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Structural and functional studies on yeast mitochondrial magnesium transporter Mrs2

Muhammad Bashir Khan

Art der Arbeit

Dissertation

Universität

Universität Wien

Fakultät

Fakultät für Lebenswissenschaften

Betreuer*in

Kristina Djinovic-Carugo

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DOI

10.25365/thesis.15122

URN

urn:nbn:at:at-ubw:1-30123.41103.934754-1

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Abstracts

Abstract

(Deutsch)

Mg2+ ist eines der am häufigsten vorkommenden zweiwertigen Kationen in Zellen und Organellen. In seinen chemischen Eigenschaften ist es im Vergleich mit anderen zweiwertigen Kationen einzigartig. Es spielt eine wichtige Rolle bei der Stabilisierung von Makromolekülen, in der Bindung an Nukleotide und als Kofaktor für zahlreiche Enzyme. Weiters beeinflusst Mg2+ das Volumen der Zelle und Signalprozesse, indem es die Aktivität von Ionenkanälen und Transportern reguliert. Die bisher charakterisierten Magnesiumtransporter sind an die einzigartigen physiochemischen Eigenschaften dieses Ions angepasst. Die Mg2+-Transporter der CorA/Mrs2 Familie gehören zur Klasse der 2-TM-GxN Proteine und zeigen keine Homologie mit anderen Ionentransportern. Sie sind in allen Domänen des Lebens vertreten und gehören zur Superfamilie der Metallionentransporter. Die am besten charakterisierten Vertreter dieser Klasse sind das Protein CorA der Prokaryoten, sowie die eukaryotischen Proteine Alr1/2 und Mrs2/Lpe10. Mrs2 bildet das Haupttransportsystem für Mg2+ in Mitochondrien bei Hefe, Pflanzen und Säugetieren und ist außerdem für die mitochondriale Mg2+ Homöostase essentiell. Das menschliche Mrs2 Protein vermittelt multiple Wirkstoffresistenz bei Magenkarzinomzellen indem es die Expression von p27 und Cyclin D1 sowie die Cytochrom C Freisetzung reguliert. Gemeinsamkeiten dieser Proteine sind zwei nahe aneinander liegende Transmembran-Helices (TM1, TM2) im C-terminalen Bereich des Proteins und das hochkonservierte F/Y-G-M-N Motiv am C-terminalen Ende von TM1. Der N-terminale Teil des Proteins besteht aus einer großen, löslichen Domäne, die eine trichterförmige Struktur besitzt. Es wurde bereits experimentell gezeigt, dass dieser Bereich ein allosterisches Regulationsmodul bildet, das so verändert werden kann, dass ein offener oder geschlossener Zustand des Kanals erreicht wird. Ist die intrazelluläre Mg2+-Konzentration niedrig, werden Mg2+-Ionen, die zwischen zwei benachbarten Monomeren gebunden sind, freigesetzt und die N-terminale Domäne des Proteins führt als insgesamt starrer Körper eine Bewegung aus. Im Gegensatz dazu kommt es bei den „willow“ Helices, zu einer Umlagerung zueinander und in Bezug auf die langen Helices, die den Trichter bilden. Diese führt schlussendlich zu einer Drehung der Helices die den Trichter bilden. Diese Drehung setzt sich bis zu den intrazellulären hydrophoben Schleusenstellen fort und aktiviert möglicherweise auch die periplasmatische Schleuse durch eine Interaktion der cytoplasmatischen, sauren Aminosäurenreste mit den C-terminalen, basischen Aminosäurenreste. Die Bewegung von TM2 und der MPEL Schleife führt dann zur Öffnung der periplasmatischen Schleuse und erlaubt schlussendlich den Einstrom von Mg2+-Ionen. Mrs2 der Hefe Saccharomyces cerevisae wurde in der Gruppe unseres Kollaborationspartners Prof. Schweyen zum ersten Mal als Magnesiumkanal charakterisiert und wird mit biophysikalischen und biochemischen Methoden intensiv studiert. In dieser Arbeit wurden verschiedene biophysikalischen und strukturbasierte Methoden angewendet, um den Mechanismus des Ionentransports durch diesen Kanal und seine Regulation auf molekularer Ebene zu klären Eine Reihe von MRS2-Konstrukten, mit Fokus auf den N-terminalen, löslichen Teil des Proteins wurden hergestellt. Das Design der Konstrukte basierte auf Bioinformatik und Ergebnissen eines begrenzten proteolytischen Abbaus des Proteins mit dem Ziel, ein funktionelles Protein zu erhalten, das aber gleichzeitig auch für die Strukturanalyse geeignet ist. Die inner-mitochondriale Domäne von Mrs2 von Saccharomyces cerevisiae wurde, in monomerischer Form, unter vier verschiedenen Bedingungen kristallisiert. Die Kristallstruktur wurde durch Einzelwellenlänge anomale Dispersion unter Ausnützung der anomale Signale des Schwefels mit einer Auflösung von 1,83 Å bestimmt. Mit den am European Synchrotron Radiation Facility (ESRF) akquirierten hoch-auflösenden Daten wurde die Struktur weiter bis zu einer Auflösung von 1,28 Å verfeinert. Die N-terminale Domäne von Mrs2 besteht aus einem sechs-strängigen ß-Faltblatt, dass zwischen zwei Sets von α-Helices liegt. Die Faltung war, wie erwartet, vergleichbar mit der N-terminalen Faltung des prokaryotischen CorA Proteins. Analytische Gelfiltration und dynamische Lichtstreuungs-Analyse haben gezeigt, dass die N-terminale Domäne von Mrs2 unter niedriger Ionenstärke Pentamere bildet. Versuche mit einer Verlängerung des C-Terminus des Proteins haben aber gezeigt, dass ein Teil der Transmembran-Helix für die Oligomerisierung der löslichen Domäne notwendig ist. Diese Beobachtung wird auch durch die von uns, auf Basis der pentamerischen CorA Kristallstruktur durchgeführte Analyse des Inter-Domänen Interface des generierten Mrs2 Modells unterstützt. Basierend auf Strukturvergleichen von Mrs2 mit seinen bekannten, funktionellen Homologen (dem bakterielle Magnesiumtransporter CorA und dem Zinktransporter ZntB) haben wir mit Asp 97 von Helix α3 das vermutliche aktive Zentrum des Proteins identifiziert. Diese Aminosäure befindet sich in großer räumlicher Nähe zum benachbarten Monomer in der funktionellen, rekonstruierten, pentamerischen Form. Ein Sequenzabgleich mit anderen eukaryotischen Magnesiumtransportern zeigt, dass im funktionellen Pentamer, die Carboxylgruppen der Aminosäuren Glu 70, vermutlich zusammen mit Asp 97 im angrenzenden Protomer das Metallion koordinieren. Beide Aminosäuren sind in der gesamten eukaryotischen Transporterfamilie hochkonserviert. In der Kristallstruktur der monomeren N-terminalen Domäne konnte kein gebundenes Metallion gefunden werden. Dennoch hat die Analyse des, auf der Basis der bereits bekannten Struktur von CorA, erzeugten pentameren Mrs2 Modells, in Kombination mit strukturbasiertem Sequenzabgleich, es uns erlaubt, die Aminosäurenreste, zu identifizieren die vermutlich die stärksten Verengungen der Pore und damit die Schleusen des Kanals bilden.

Abstract

(Englisch)

Mg2+ is one of the most abundant divalent cations in cells and organelles. Magnesium is unique in its chemical properties compared to the other cations. It plays an important role in stabilizing macromolecules and in binding to nucleotides. Furthermore, it acts as a cofactor of a number of different enzymes. Mg2+ also influences cell volume and signalling processes by modulating the activities of ion channels and transporters. The magnesium transporters discovered to date have unique characteristics, which correlate with the typical physicochemical properties of Mg2+ cations. The CorA/Mrs2 family of Mg2+ transporters belongs to a class of transporters known as 2-TM-GxN with no homology to other ion transporters. This class of ion transporters is wide spread in all domains of life and belongs to the metal ion transporter superfamily. The best studied members of this family are the CorA protein of prokaryotes, and the eukaryotic Alr1/2 and Mrs2/Lpe10 proteins. Mrs2 transporters form the major mitochondrial Mg2+ uptake system in yeast, plants and mammals and are essential for mitochondrial Mg2+ homeostasis. Human Mrs2 is involved in promoting multidrug resistance in gastric cancer cells by regulating p27, expression of cyclin D1 and release of cytochrome C. Common features of all of these proteins are the presence of two adjacent transmembrane helices (TM1, TM2) near their C-terminus and the highly conserved GMN sequence motif at the very end of TM1. The N-terminus is characterized by a large soluble domain which forms a funnel like structure and is shown to constitute an allosteric regulatory module that can be designed to promote an open or closed state. In the absence of sufficient intracellular Mg2+ levels, Mg2+ ions bound between monomers are released, the N-terminal domains move as a rigid body, whereas the willow helices undergo a rearrangement with respect to one another and relative to the stalk helices (pore forming helices). This causes a torque along the stalk helix. The torque propagates onto the intracellular hydrophobic gates and possibly activates the periplasmic gate by interaction of the cytoplasmic, acidic residues and the C-terminal, basic residues. This causes an infringe on periplasmic gating residues through movement of TM2 and the MPEL motif loop and thus allow Mg2+ ions to flow through. Mrs2 from Saccharomyces cerevisae is being extensively studied biophysically and biochemically by our collaborative group of Prof Rudolf J. Schweyen (late) who discovered the MRS2 gene in the late eighties. In this work, a number of efforts based on biophysical methods and structural studies have been carried out in order to elucidate the mechanism of magnesium transport at the molecular level across the membrane and to enhance insights into the regulation of the transport. In this thesis, several constructs of Mrs2 were prepared, focusing on the soluble N-terminal inner mitochondrial domain of Mrs2. They were designed based on bioinformatics, limited proteolysis in order to determine the construct which behaves as a functional protein and at the same time being suitable for structural studies. The inner mitochondrial domain of Mrs2 from Saccharomyces cerevisae was crystallized in four different conditions in the monomeric form and its crystal structure solved by a single-wavelength anomalous dispersion exploiting sulphur anomalous signal at 1.83 Å. This structure was then further refined against the high resolution data set at 1.28 Å, collected at European Synchrotron Radiation Facility (ESRF). The N-terminal domain of Mrs2 is a six-stranded anti-parallel β-sheet sandwiched between two sets of α-helices and adopts the expected, a prokaryotic CorA N-terminal like fold. Analytical gel filtration and dynamic light scattering showed that the N-terminal domain of Mrs2 forms pentamers at low salt concentration. Extension of the C-terminus shows that a portion of the trans-membrane helix is necessary for the oligomerisation of the soluble domain, this is also supported by our analysis of the inter-domain interface of the Mrs2 model generated on the CorA pentameric crystal structure. Based on the structural comparison with known functional homologues (CorA, the bacterial magnesium transporter, ZntB, the bacterial zinc transporter) of Mrs2, we have identified the presumed active site which is formed by an Asp 97 of α3, located in close proximity to the neighbouring monomer in a functional reconstructed pentameric form. A sequence alignment of eukaryotic magnesium transporters reveals that the carboxylate residues of Glu 270 possibly coordinate the metal ion together with Asp97 of the adjacent protomer in the functional pentamer, and that both residues are highly conserved in the whole family of eukaryotic Mrs2 proteins. In the crystal structure of the monomeric N-terminal domain no bound metal was found at the putative metal binding site. The analysis of the pentameric Mrs2 model constructed on the known structure of CorA together with structure based amino acid sequence alignment, allowed us to identify the putative gate forming residues forming the narrowest constriction along the pore.

Autor*innen

Muhammad Bashir Khan

Haupttitel (Englisch)

Structural and functional studies on yeast mitochondrial magnesium transporter Mrs2

Paralleltitel (Deutsch)

Struktur- und Funktionsstudien am mitochondrialen Magnesiumtransporter Mrs2 der Hefe

Publikationsjahr

2011

Umfangsangabe

VI, 161 S. : Ill., graph. Darst.

Sprache

Englisch

Beurteiler*innen

Christoph Romanin ,

Manfred Weiss

Klassifikationen

42 Biologie > 42.13 Molekularbiologie ,

42 Biologie > 42.20 Genetik

AC Nummer

AC09408889

Utheses ID

13568

Studienkennzahl

UA | 091 | 490 | |

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Schlagwörter