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Inducible control of plasmid copy number for the production of therapeutic plasmids

Esther Egger

Art der Arbeit

Diplomarbeit

Universität

Universität Wien

Fakultät

Zentrum für Molekulare Biologie

Betreuer*in

Angela Witte

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URN

urn:nbn:at:at-ubw:1-29826.50867.359065-2

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(Print-Exemplar eventuell in Bibliothek verfügbar)

Abstracts

Abstract

(Deutsch)

TITELBLATT: nur in PRINTAUSGABE! -- Die therapeutische Verwendung von DNA anstelle von Proteinen ist zu einem bedeutenden Gegenstand medizinischer Forschung geworden. Die Entwicklung neuer Therapieformen wie der Gentherapie und DNA-Impfstoffen hat den Bedarf an hochwertiger Plasmid-DNA stark gesteigert. Die Regulation der Plasmidkopienzahl (PCN) ist dabei für eine optimale DNA-Ausbeute ausschlaggebend. Eine zu starke Plasmidreplikation würde nämlich zu einer Überlastung und schließlich zum Zusammenbruch des bakteriellen Stoffwechsels führen. Gegenstand dieser Arbeit war es die Replikation von Plasmiden mit ColE1-ori mittels RNA-RNA-Interaktion sowie tRNA-RNA-Wechselwirkung regulierbar zu machen. Dazu wurde in einem ersten Schritt das RNAI-Gen unter der Kontrolle des T7- Promotors ins bakterielle Escherichia coli (E.coli) Genom integriert. In Schüttelkolbenversuchen wurde anschließend die RNAI-Expression durch die Zugabe von Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid (IPTG) induziert und ihre Auswirkung auf die Replikation verschiedener ColE1-Plasmide untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass die Überexpression von RNAI zu einer starken Reduktion der PCN führt. Da es sich beim T7-System allerdings um ein sehr undichtes handelt, wurde dieser Effekt auch im uninduzierten Zustand sichtbar. Deshalb wurde der T7- Promotor in einem weiteren Schritt durch den pLlacO-1 Promotor ersetzt wodurch eine regulierbare RNAI-Expression möglich wurde. Nur im Fall der Induktion durch IPTG wurde die PCN gesenkt. In einem weiteren Ansatz wurde versucht die Plasmidreplikation durch die Überexpression von unbeladenen tRNAs zu steigern. Dazu wurde das tRNAAla-Gen unter die Kontrolle des T7-Promotors gebracht und wiederum ins E.coli Genom integriert. Zwei Punktmutationen in diesem Gen verhinderten dabei die Beladung der tRNA-Moleküle mit Alanin. Auch in diesem Fall wurde die Genexpression in Schüttelkolbenversuchen durch die Zugabe von IPTG induzierte, und deren Auswirkung auf die Replikation von ColE1-Plasmiden untersucht. Laut bereits existierenden Publikationen, sollte es zur Wechselwirkung zwischen unbeladener tRNA und RNAI kommen. Der daraus resultierende Anstieg an freier RNAII sollte in weiterer Folge zu einer Erhöhung der PCN führen. 5 Mit dieser Arbeit wurde gezeigt, dass die PCN von ColE1-Plasmiden über die Expression einer chromosomalen Kopie des RNAI-Gens unter dem pLlacO-1 Promotor reguliert bzw. reduziert werden kann. Die Expression des chromosomalen tRNAAla- Gens bewirkte, entgegen den Erwartungen, eine Senkung der PCN.

Abstract

(Englisch)

The application of naked DNA instead of therapeutic proteins has become a main subject of medical investigation. The development of new therapeutic methods like gene therapy and DNA vaccination has caused a growing demand for high quality plasmid DNA (pDNA). For an optimal yield of pDNA, it is important to be able to regulate plasmid copy number (PCN) as extensive plasmid replication exerts metabolic burden on the host cell, and as a consequence leads to growth cessation. In this work, control of PCN of ColE1-type plasmids should be achieved by RNA-RNA interaction as well as by RNA-tRNA interaction. In a first approach the RNAI-gene was inserted into the E.coli chromosome and put under the control of the T7 promoter. By the addition of isopropyl-beta-Dthiogalactopyranoside (IPTG), RNAI-expression was induced in shake flask experiments and the influence on different ColE1-type plasmids was followed. It could be shown that extensive RNAI expression resulted in a dramatic decrease of PCN. As this effect was also observed in the case of no IPTG addition the leaky T7- system was exchanged by the pLlacO-1 promoter. By the use of this promoter, RNAI expression was restricted to IPTG addition. In a second approach regulation of PCN should be achieved by tRNA over expression. It was reported recently, that uncharged tRNAs can interact with RNAI, thereby mediating cleavage of RNAI. Reduction of functional RNAI should further lead to an increase in the number of uninhibited RNAII molecules and thus, in enhanced initiation of plasmid replication. Therefore, a chromosomal copy of the tRNAAla-gene was brought under the control of the T7 promoter. Because of two point mutations charging of tRNA molecules was inhibited. Expression was again induced by the addition of IPTG in shake flask experiments and PCN of ColE1-type plasmids was determined. With this work it could be demonstrated, that PCN of ColE1-type plasmids can be regulated and reduced, respectively by the expression of a chromosomal copy of the RNAI-gene under the control of the pLlacO-1 promoter. The over expression of 3 uncharged tRNAs however, showed an unexpected effect. Contrary to publications, predicting an increase in plasmid replication, expression of tRNA led to a clear reduction of PCN.

Autor*innen

Esther Egger

Haupttitel (Englisch)

Inducible control of plasmid copy number for the production of therapeutic plasmids

Paralleltitel (Deutsch)

Induzierbare Kontrolle der Plasmidkopienzahl zur Herstellung von thereuptischen Plasmiden

Publikationsjahr

2008

Umfangsangabe

79 S. : Ill., graph. Darst.

Sprache

Englisch

Beurteiler*in

Angela Witte

Klassifikation

42 Biologie > 42.13 Molekularbiologie

AC Nummer

AC07660751

Utheses ID

2631

Studienkennzahl

UA | 490 | | |

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Schlagwörter