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Molecular and cultivation-based analyses of nitrifying communitites from mesophilic and thermophilic environments
Nathalie Schuster
Art der Arbeit
Diplomarbeit
Universität
Universität Wien
Fakultät
Fakultät für Lebenswissenschaften
Betreuer*in
Michael Wagner
DOI
10.25365/thesis.9096
URN
urn:nbn:at:at-ubw:1-29716.39068.558463-0
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(Print-Exemplar eventuell in Bibliothek verfügbar)
Abstracts
Abstract
(Deutsch)
Nitrifikation stellt einen Schlüsselprozess des globalen Stockstoffkreislaufes dar und
wird von zwei verschiedenen Gruppen von Mikroorganismen katalysiert: ammoniak-oxidierenden
Bakterien (AOB) und nitrit-oxidierenden Bakterien (NOB). Die kürzliche
Entdeckung von ammoniak-oxidierenden Archaeen (AOA) in diversen terrestrischen
und marinen Habitaten veränderte das Bild der potentiell beteiligten Mikroorganismen
im Stickstoffkreislauf. Das metabolische Schlüsselenzym der ammoniak-oxidierenden
Mikroorganismen (AOM) stellt die Ammoniak Monooxygenase (Amo) dar, und jenes
der NOB die Nitrit Oxidoreduktase (Nxr). Amo und nxr Gene werden zur funktionellen
und phylogenetischen Analyse von nitrifizierenden Mikroorganismen als Markergene
eingesetzt.
In dieser Studie wurde die Physiologie des moderat thermophilen chemoautotrophen
AOA “Candidatus Nitrososphaera gargensis”, einem Mitglied der Gruppe I.1b der
Crenarchaeota, auf potentielles mixotrophes Wachstum mittels Mikroautoradiographie
(MAR) getestet. Mesophile Crenarchaeoten sind sehr abundant und es gibt Hinweise
auf ihr mixotrophes oder heterotrophes Wachstum, weshalb diverse Studien alternative
Metabolismen und Wachstumsstrategien mesophiler Crenarchaeoten in Betracht
ziehen. Bedauerlicherweise wurde in der Bicarbonat-Totkontrolle des Experiments ein
positives MAR Signal beobachtet und für die weiteren verwendeten Substrate keine
jeweils eigene Totkontrolle vorbereitet. Daher war es unmöglich zu unterscheiden, ob
die MAR Signale aus der Adsorption der Substrate an die Zelloberfläche oder aus der
Inkorporation der Substrate in die Zelle resultierten.
Zusätzlich sollten die bakteriellen Begleitorganismen in der nitrifizierenden, thermophilen
Anreicherung von “Candidatus Nitrososphaera gargensis” identifiziert und nachgewiesen
werden, unter anderem um die Kultivierungsstrategie verbessern zu können. Früherdurchgeführte MAR Experimente gaben bereits Hinweise auf heterotrophe Bakterien
mit stäbchenförmiger Morphologie. Ein Kontaminant war bereits vor der Studie als
putativer AOB identifiziert worden. Im Laufe der Arbeit konnte ein weiterer Kontaminant
anhand seiner 16S rRNA Sequenz identifiziert werden. Trotz mehrfacher Ansätze
und Versuche war es nicht möglich, die Identität weiterer Kontaminanten anhand des
16S rRNA Ansatzes und mit Fingerprint-Methoden wie DGGE und T-RFLP in der Anreicherung
zu bestimmen. Dieses Ergebnis wurde auch durch metagenomische Analyse
der Anreicherung unterstützt.
Um autotrophes Wachstum der putativen AOB nachzuweisen, wurden Zellen mit isotopenmarkiertem
Bicarbonat inkubiert. Die Inkubationen wurden mittels Raman-
Mikrospektroskopie untersucht und ausgewertet. Da keine markierten Zellen entdeckt
wurden ist es möglich, dass die Inkubation der AOB mit stabilen Isotopen zu kurz war
um markierte Zellen mittels Raman-Mikrospektroskopie zu detektieren, oder, dass die
“putative AOB” kein Ammoniak oxidieren können.
Ein zweiter wichtiger Teil der Arbeit beinhaltete den Versuch, neue nitrifizierende
Mikroorganismen aus verschiedenen Umweltproben anzureichern. Dazu wurden Kulturen
mit Erde und Klärschlamm angesetzt. Allerdings konnten keine Nitrifikanten
angereichert werden, da trotz der Zugabe von Antibiotika die Kulturen nach kurzer
Zeit von Pilzen überwachsen waren.
In einem weiteren Versuch nitrifizierende Mikroorganismen anzureichern wurde Biofilm,
der auf den Filteranlagen eines Aquariums des Haus des Meeres wuchs, als Inokulum
für die Anreicherungskulturen verwendet. Hier konnten sowohl bakterielle und
archaeelle 16S rRNA Gene als auch die funktionellen Gene amoA und nxrB amplifiziert
werden. Außerdem wurde in den Anreicherungen ein Verbrauch von Ammoniak
und Nitrit beobachtet. In keiner der Kulturen waren Archaeen abundant. Weiters
konnten keine bekannten AOB gefunden werden, in einigen Kulturen wurde jedoch
Nitrococcus mobilis, ein Nitrit Oxidierer, identifiziert. Die Erstellung einer Klonbibliothek
und anschließende Sequenzanalysen bestätigten die Identität der angereicherten
NOB als Nitrococcus mobilis basierend auf einer 16S rRNA Ähnlichkeit von
100%. Allerdings konnten in anderen Kulturen, die ebenfalls aktiv Nitrit konsumierten,
weder NOB identifiziert, noch ihre 16S rRNA Gene in den dazugehörigen Klonbibliotheken
gefunden werden. Eine Ausnahme stellten drei Klone dar, die in einer
Kultur gefunden wurden und große Ähnlichkeit zu Nitrospira marina aus der Untergruppe
IV des Genus Nitrospira aufwiesen. Um autotrophesWachstum von Nitrococcus
mobilis auf Einzelzellebene nachzuweisen, wurden die Zellen mit 13C-markiertem Bicarbonat
inkubiert und anschließend mittels Raman-Mikrospektroskopie untersucht. Mit Raman-FISH konnte schließlich autotrophes Wachstum von Nitrococcus mobilis
gezeigt werden. Zusammenfassend zeigen die Ergebnisse dieser Kultivierungen, dass
Biofilm aus Aquarium-Filteranlagen eine geeignete Umweltprobe für Anreicherungen
von nitrifizirenden Mikroorganismen darstellte und in einigen Kulturen Nitrococcus
mobilis erfolgreich angereichert werden konnte. Mikrobielle Biofilme in Kulturen,
die Nitrit oxidierten, in denen jedoch keine NOB identifiziert werden konnten, bestanden
möglicherweise nur zu einem sehr geringen Anteil aus Nitrifikanten oder aber
enthielten neue und unbekannte nitrifizierende Mikroorganismen. Eine andere plausible
Erklärung dafür, dass keine NOB gefunden werden konnten, ist die Möglichkeit,
dass sich die NOB an die Wände der Glasflaschen, in denen sie inkubiert wurden,
anlagerten und somit übersehen wurden.
Die Druckversion der Diplomarbeit enthält eine Multimediabeilage (CD) mit Messdaten, die hier am Ende der Diplomarbeit angehängt sind.
Abstract
(Englisch)
Nitrification is a key part of the global nitrogen cycle and until recently was thought to
be catalyzed only by two distinct groups of microorganisms, ammonia-oxidizing bacteria
(AOB) and nitrite-oxidizing bacteria (NOB). However, the recent detection of
ammonia-oxidizing archaea (AOA) in various terrestrial and marine habitats changed
the view of the potential key players in nitrogen cycling. For functional and phylogenetic
analysis of nitrifying microorganisms, the genes for the key metabolic enzyme of
ammonia-oxidizing microorganisms (AOM), ammonia monooxygenase (Amo), and of
NOB, nitrite-oxidoreductase (Nxr) are used as markers.
In this study, the physiology of the moderately thermophilic chemoautotrophic AOA
“Candidatus Nitrososphaera gargensis”, a member of the soil group I.1b of crenarchaeota,
was investigated for potential mixotrophic growth using microautoradiography
(MAR). Since mesophilic crenarchaeota are very abundant and possibly are capable
of mixotrophic or heterotrophic growth, studies suggest that potential alternative
metabolisms and growth strategies for mesophilic crenarchaeota have to be considered.
Unfortunately, only a dead control was performed for bicarbonate, which showed a
positive MAR signal. Therefore it is impossible to tell whether MAR signals resulted
from substrate adsorption on the cell surface or from incorporation of substrates.
Additionally, the nitrifying thermophilic enrichment culture of “Candidatus Nitrososphaera
gargensis”was screened for contaminants. The aim was to identify contaminants
and use this knowledge also to optimize cultivation strategies. Former MAR experiments
identified the contaminants as heterotrophs with a rod-shaped morphology, and
one contaminant already has been identified as a putative AOB. One new member of
the contaminating population could be identified by its 16S rRNA sequences. Despite
several attempts, it was not possible to detect other contaminants in the enrichmentby the 16S rRNA approach, and DGGE or T-RFLP. This is in agreement with other
analysis, such as metagenomics.
To proof autotrophic growth of the putative AOB, stable isotope probing with labeled
bicarbonate and Raman microscopic analysis were performed. However, no labeling
could be detected, suggesting that the incubation time was too short to detect labeling
via Raman spectroscopy or that “putative AOB”are not able to oxidize ammonia.
Furthermore, in order to find novel nitrifying microorganisms, enrichment cultures with
soil and sludge from a WWTP were performed. No nitrifiers could be enriched, since
despite antibiotics cultures were rapidly overgrown by fungi.
In a second attempt to enrich nitrifying microorganisms, biofilm growing on filter
balls from an aquarium pool in the “Haus des Meeres”was used as inoculum. It was
possible to amplify bacterial and archaeal 16S rRNA genes as well as the functional
genes amoA and nxrB from the biofilm. In addition, decrease of ammonia and nitrite
could be observed in the enrichments. In none of the cultures high numbers of archaea
could be detected. No known AOB could be identified, however, in some cultures
Nitrococcus mobilis, a member of NOB, was detected. A clone library and sequence
analysis confirmed that the enriched NOB were indeed 100% similar on 16S rRNA
level to the isolated Nitrococcus mobilis. However, in other active cultures no NOB
could be detected and in clone libraries no 16S rRNA genes of nitrifiers were found,
except for one culture, in which three clones were most similar to Nitrospira marina
from “sublineage IV”of the genus Nitrospira. In order to show autotrophic growth
of Nitrococcus mobilis on a single-cell level, a culture that was incubated with 13Clabeled
bicarbonate was investigated using Raman microscopy. Finally, Raman-FISH
analysis provided proof of autotrophic growth of Nitrococcus mobilis. Taken together,
the obtained results show that biofilm from aquarium water provided a good sample
for enrichments of nitrifying microorganisms and that in some cultures Nitrococcus
mobilis was successfully enriched. Nitrite-oxidizing cultures, in which no NOB could
be identified, possibly contained only a very low amount of nitrifiers or harbored new
microorganisms involved in nitrification. Another plausible explanation is that NOB
attached to the glass surface of the incubation flasks and were overlooked.
The printed version of the diplma thesis contains a Multimediabeilage (CD) with measuring data, which are now attached at the end of the thesis.
Schlagwörter
Schlagwörter
(Englisch)
nitrification ammonia-oxidizing bacteria nitrite-oxidizing bacteria thermophilic ammonia-oxidizing archaea microautoradiography heterotrophy autotrophy Raman-microspectroscopy Raman-FISH cultivation of nitrifiers
Schlagwörter
(Deutsch)
Nitrifikation ammoniak-oxidierende Bakterien nitrit-oxidierende Bakterien thermophile ammoniak-oxidierende Archaea Mikroautoradiographie Heterotrophie Autotrophie Raman-Mikrospektroskopie Raman-FISH Kultivierung von Nitrifikanten
Autor*innen
Nathalie Schuster
Haupttitel (Englisch)
Molecular and cultivation-based analyses of nitrifying communitites from mesophilic and thermophilic environments
Paralleltitel (Deutsch)
Molekulare und kultivierungsbasierende Analysen von nitrifizierenden Gemeinschaften aus mesophilen und thermophilen Lebensräumen
Publikationsjahr
2010
Umfangsangabe
175 S.
Sprache
Englisch
Beurteiler*in
Michael Wagner
Klassifikationen
42 Biologie > 42.13 Molekularbiologie ,
42 Biologie > 42.30 Mikrobiologie
AC Nummer
AC08167653
Utheses ID
8199
Studienkennzahl
UA | 441 | | |