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Proteomic studies on Chlamydomonas reinhardtii

Munoz Luis Recuenco

Art der Arbeit

Dissertation

Universität

Universität Wien

Fakultät

Fakultät für Lebenswissenschaften

Studiumsbezeichnung bzw. Universitätlehrgang (ULG)

Doctor of Philosophy-Doktoratsstudium NAWI Bereich Lebenswissenschaften (Dissertationsgebiet: Biologie)

Betreuer*innen

Wolfram Weckwerth ,

Stefanie Wienkoop

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DOI

10.25365/thesis.48009

URN

urn:nbn:at:at-ubw:1-22772.94768.721262-2

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(Print-Exemplar eventuell in Bibliothek verfügbar)

Abstracts

Abstract

(Deutsch)

Systembiologie kann als ein holistischer Ansatz beschrieben werden, laut dessen ein Organismus nicht als Summe seiner Bestandteile betrachtet wird, sondern auch deren Interaktion und Dynamik berücksichtigt. Diese Strategie führte zur Entwicklung der -Omics Studien. Ziel der Omics-Studien ist es, den gesamten Satz einer gewissen Makromolekülenklasse eines Organismus zu einem bestimmten Zeitpunkt zu detektieren, identifizieren und wenn möglich quantifizieren. In der vorliegenden Arbeit wurden vier zentrale Fragestellungen der Proteomanalyse in der einzelligen Modellalge Chlamydomonas reinhardtii behandelt: 1- Die Datensätze aus diesen und auch aus anderen Proteomics-Studien an verschiedenen Pflanzensorten wurden benutzt, um den MAPA (Mass Accuracy Precursor Alignment) Workflow zu implementieren. Diese Strategie umfasst die Kombination des ProtMax Algorithmus mit multivariater Statistik. In Hoehenwarter et al. 2011 wird die Anwendung von MAPA für funktionellen Studien und Proteinspezifikation diskutiert und erfolgreich an einer Studie über Signalinduktionskaskaden nach Phytohormonbehandlung an Arabidopsis thaliana angewendet: hier wurden nicht nur phosphorylierte Peptide identifiziert, sondern auch ihre jeweilige Phosphorylierungsstelle. 2- Experimentelle Datensätze von Proteomics-Untersuchungen können auch für Genomannotationsstudien und Verbesserung der bestehenden, manuell gewarteten Proteindatenbanken dienen. Proteindatenkbanken können sowohl aus verschiedenen Genomrekonstruktionen als auch aus verschiedenen Annotationen der gleichen Genomrekonstruktion stammen — dabei können verschiedene Proteindatenbanken signifikante Unterschiede bei der Analyse des gleichen Datensatzes erzeugen. Dies wurde gestestet, indem ein bestimmter Chlamydomonas reinhardtii Datensatz mit vier verschiedenen Datenbanken analysiert wurde. Diese Datenbanken stammen aus mehreren Annotationen von zwei verschiedenen Genomrekonstruktionen. Die Ergebnisse aus diesem Vergleich wurden in Valledor et al. 2012 grafisch dargestellt, die entsprechenden Über- -lappungen veranschaulicht, und die Ergebnisse aus verschiedenen Identifizierungsstrategien analysiert (Einzelpeptidbestimmung, Proteinbestimmung mit 2 Peptiden). Hier wurden signifikante Unterschiede zwischen den verschiedenen Datenbanken gefunden — tatsächlich wird nicht nur die qualitative Analyse (z.B. verschiedene Genomannotationen ergeben verschiedene Protein-IDs) sondern auch die quantitative Proteinanalyse (z.B. durch Nichtidentifizierung notwendiger Peptide für die Validierung ihrer ursprünglicher Proteine) entscheidend beeinflußt. 3- Um den Zusammenhang zwischen N-Streß und erhöhter TAG-Akkumulation in CR zu untersuchen, wurde ein Experiment geplant, welches die Anpassung über 72 Stunden N-Mangel und die Erholung 24 Stunden nach N-Zugabe verfolgen sollte. Dabei wurden Proteomics und Metabolomics Untersuchungen an komplette Zellextrakte und auch aufgereinigte Zellkernfraktionen durchgeführt und mit klassischen physiologischen Messungen kombiniert — die entstehenden Ergebnisse wurden zusätzlich mit bereits bestehenden Metabolomics und Transcriptomics-Datensätzen verglichen. Um die Zusammenhänge zwischen N-Metabolismus, Lipidakkumulation, Zellwachstum und etliche Veränderungen in der Lipidzusammensetzung der Zelle zu veranschaulichen wurden die gewonnenen Daten mithilfe multivariater Statistik prozessiert und schließlich in einem metabolischen Netzwerk visualisiert. Durch diese Strategie gelang es Valledor et al. 2014, neue Erkenntnisse über die physiologischen Mechanismen von Chlamydomonas reinhardtii zur Anpassung an N-Mangel und von N-Mangel zurück zum Ausgangszustand zu erlangen. Dabei konnten signifikante Veränderungen auf Organell-, Protein- und Lipidniveau gefunden werden, genauso wie potentielle Target-Gene, dessen Manipulation durch Bioengineering zu einer Erhöhung der Lipidakkumulation der Alge führen könnte. 4- Nachdem Evidenz aus unseren vorigen Untersuchungen auf eine von 1:1 abweichende Stöchiometrie von beiden RuBisCO Untereinheiten hinwies, wurde eine Studie durchgeführt, um diese Hypothese gründlich zu untersuchen. Dafür wurden beide Untereinheiten mittels einer neuen Entwicklung des Mass Western (Lehmann 2008) untersucht, dessen Standardpeptide aus aneinandergereihten, querverknüpften Peptidsequenzen aus beiden RuBisCO-Untereinheiten bestanden — dazu wurde auch einen zusätzlichen, doppelt-markierten Equalizer-Peptid zu genaueren Quantifizierung benutzt. Um etliche präparativ erzeugten Artefakte auszuschließen, wurden die Mengen der beiden Untereinheiten in Messproben aus (a) rohen Zellextrakten (b) präfraktionierten Proteinextrakten und (c) purifiziertem RuBisCO-Holoenzym quantifiziert. Zusätzlich wurden diese Proteindaten mit Transkriptdaten über einen 24stündigen Zeitintervall korreliert, um die Dynamik der RSU-Expression über ein Licht/Dunkel Tageszyklus zu verfolgen. Die von mir in Recuenco-Munoz et al. 2015 publizierten Ergebnisse nicht nur bestätigen die 5:1 Stöchiometrie für LSU:SSU, sondern zeigen auch eine Oszillation der LSU-Konzentration über den Tageszyklus. Da diese Oszillation eine Verschiebung von 9h zwischen der höchsten mRNA-Konzentration (im Dunkel) und der höchsten LSU-Konzentration zeigt, könnte man eine lichtbedingte Regulation der LSU-Synthese annehmen. Zudem wurde eine Akkumulation eines 37-kDa N-Proteinfragmentes der LSU gemessen, dessen positiven Korrelation mit der C-Assimilation auf eigene katalytische Aktivität hinweisen könnte. Die vorliegende Arbeit deckt somit nicht nur eine grosse Bandbreite an Techniken und Herausforderungen der heutigen Proteomics-Forschung in der molekularen Pflanzenphysiologie ab, sondern bringt neue Ansichten über den C- und N-Stoffwechsel einer der relevantesten Modellalgen, Chlamydomonas reinhardtii (RuBisCO, Lipidproduktion unter N-Mangel). Schließlich wurden neue Methoden und Strategien entwickelt, die sowohl in funktionellen (z.B. MAPA, new Mass Western) als auch in industriellen Studien (Steigerung der Lipidproduktion durch Bioengineering) Anwendung finden könnten.

Abstract

(Englisch)

Systems Biology can be described as a holistic approach striving to analyze an organism as a biological system, integrating the characterization of its components and the description of their interactions and dynamics. This strategy led to the development of the -omics studies, which aim at collecting the complete set of a determined kind of biomolecules from an organism at a certain time point (e.g. transcriptomics: mRNA; proteomics: proteins; metabolomics: metabolites, etc). Thus, high-throughput technologies that allow highly reproducible measurements and large data production must be applied: a good example is the use of Mass Spectrometry (MS) for Proteomics studies. My PhD thesis continues our previous work with two comprehensive -omics publications on Chlamydomonas reinhardtii, exploring different applications of LC-MS/MS for Proteomics studies on this organism. Chlamydomonas reinhardtii, a unicellular algae with high ability to adapt dynamically to environmental conditions, great relevance as a model plant, and also increasingly important as a potential bioproducer of fuel and biomass. This line of work has led to two publications previous to this PhD-Thesis, both of which I co-authored: May et al 2008 and Wienkoop et al. 2010. This PhD-Thesis comprehends four different topics within the context of the proteomic study of Chlamydomonas reinhardtii: 1- The data gained from this and also previous studies were also used to implement the Mass Accuracy Precursor Alignment (MAPA) strategy, which is based on the combination of the ProtMax algorithm and multivariate statistics (PCA/ICA). On Hoehenwarter et al.2011 the application of this workflow for search of functional PTMs for protein speciation in samples from different species is discussed. The MAPA approach was successfully applied on a study of the phosphorylation state of key components of signal induction cascades after phytohormone treatment in Arabidopsis thaliana — not only were the phosphorylated peptides identified, but also their phosphorylation site. 2- Proteomics data can also be used to enhance genomic annotation and implement the currently existing protein databases, since databases made of different genome assemblies and even from the same genome assembly but different annotations can still significantly influence the results of a proteomics study. Hence, four different databases made from different annotations of two different genome assemblies were tested for the same proteomics dataset. On Valledor et al. 2012 these results are displayed graphically, mapping the identified proteins, evaluating the overlaps between different databases, and also comparing the outcomes of single peptide and two-peptide protein identification for each database, showing significant differences for both qualitative and quantitative analysis — in fact, different databases can significantly alter both qualitative analyses (different IDs in different annotations) and quantitative protein analysis (with key peptides for protein validation not being identified at all). 3- A qualitative/semiquantitative experiment was developed for a Nitrogen deprivation study during a four day cycle, comprising three days of Nitrogen depletion and 24h of Nitrogen repletion for recovery. To establish the connection between N-metabolism, lipid accumulation, cell growth and eventual changes in membrane composition, proteomic and metabolomic data were gained from whole cell extracts and isolated nuclear fractions, correlated with physiological measurements and mapped. Subsequently, these data were further correlated with an existing transcriptomic dataset, and associated to a metabolic network. This approach led to new insights into physiological mechanisms for both adaptation to N-starvation and its recovery after N-repletion, finding significant changes at organelle (e.g. differential ribosome accumulation), protein and lipid levels (e.g. downregulation of PS-relative proteins and changes in both lipid amount and lipid composition during N-starvation), and finding putative target genes to increase lipid accumulation through bioengineering (e.g. overexpression of the BRI1 suppressor, as published in Valledor et al. 2014). 4- After having found evidence of different stoichiometry for the large and the small RuBisCO subunit in our previous work, a new strategy was developed, including enhanced Mass Western via cross-concatenated peptides for absolute quantification and combining it with different extraction and prefractionation methods to exclude any kind of technical artefacts. Furthermore, the protein data were correlated with transcript data over a diurnal cycle to follow the dynamic of RuBisCO-Expression during a light/dark cycle and discuss possible physiological effects of the diurnal oscillation of the large subunit. The results of this study, published on Recuenco-Munoz et al. 2015 do not only confirm the 5:1 stoichiometry for LSU:SSU and a possible light regulation of LSUs diurnal cycle, but also bring evidence for the accumulation of a 37kDa N-fragment from LSU and its possible physiological functions - the positive correlation of C-assimilation and the amount of 37kDa N-fragment suggests a catalytic activity of its own. As a result, my PhD-Thesis not only covers a wide range of applications and challenges of the current Proteomics plant research (different strategies for quantitative/qualitative analysis and a comparative study on protein databases), but also deals with relevant aspects of the Chlamydomonas reinhardtii metabolism, bringing new insights on key aspects of its C- and N-metabolism (RuBisCO, N-starvation and recovery) and offering new tools and suggestions for both functional studies (MAPA) and industrial application (bioengineering targets for improved lipid production).

Autor*innen

Munoz Luis Recuenco

Haupttitel (Englisch)

Proteomic studies on Chlamydomonas reinhardtii

Paralleltitel (Deutsch)

Proteomische Studien auf Chlamydomonas reinhardtii

Publikationsjahr

2017

Umfangsangabe

139 Seiten : Illustrationen, Diagramme

Sprache

Englisch

Beurteiler*innen

Dirk Walther ,

Waltraud Schulze

Klassifikation

30 Naturwissenschaften allgemein > 30.03 Methoden und Techniken in den Naturwissenschaften

AC Nummer

AC14470746

Utheses ID

42421

Studienkennzahl

UA | 794 | 685 | 437 |

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