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Characterization of distinct functional domains of Pax5 in vivo

Sarah Grünbacher

Art der Arbeit

Masterarbeit

Universität

Universität Wien

Fakultät

Fakultät für Lebenswissenschaften

Studiumsbezeichnung bzw. Universitätlehrgang (ULG)

Masterstudium Molekulare Mikrobiologie, Mikrobielle Ökologie und Immunbiologie

Betreuer*in

Meinrad Busslinger

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DOI

10.25365/thesis.48004

URN

urn:nbn:at:at-ubw:1-22771.36910.127654-4

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Abstracts

Abstract

(Deutsch)

B Lymphozyten sind Teil des Hämatopoetischen Systems. Diese Zellen sind in der Lage hoch- affine Antikörper zu produzieren, welche die humorale Immunität gegen fremde Pathogene bilden. Das Eintreten der B Zelle in die B Zelllinie, findet in dem pro-B-Zell-Stadium statt. Die B-Zell-Entwicklung wird durch zahlreiche externe Signale und Transkriptionsfaktoren kontrolliert, wie zum Beispiel das paired box protein 5 (Pax5). Der multifunktionale Transkriptionsfaktor Pax5 führt eine duale Rolle in der B-Zell-Entwicklung aus: es unterdrückt die Expression von nicht-B Zell-spezifischen Genen und aktiviert gleichzeitig B Zell- spezifische Gene. Dadurch induziert Pax5, dass B Zellen in der B Zelllinie bleiben und kontrolliert die Aufrechterhaltung der B-Zell-Identität während der B-Zell-Entwicklung. Das Protein Pax5 besteht aus mehreren konservierten Domänen, welche bis jetzt nur in Zelllinien in vitro genauer charakterisiert wurden. Um die Funktion der Domänen in vivo zu untersuchen, wurden vier verschiede Mauslinien generiert, in denen Pax5 in unterschiedlicher Weise mutiert wurde. Zwei Pax5 Mauslinien wurden hergestellt, indem entweder die Homeodomäne deletiert wurde, oder zwei mitogen-activated protein kinase- (MAPK) Phosphorylierungsstellen mutiert wurden. Obwohl die B-Zell-Entwicklung in diesen Mäusen normal verläuft, kommt es durch Lipopolysaccherid (LPS) Stimmulation in vitro und durch 4-Hydroxy-3-Nitrophenyl Acetyl- Schlitzschnecken Hämocyanin (NP-KLH) Immunisierung in vivo zu einer fehlerhaften B-Zell-Aktivierung. Der Phosphorylierungs- Mutante zeigte eine reduzierte Zellteilung in vitro und niedrigere Level an Immunoglobulin (Ig)M, IgG3, IgG2b. Interessanterweise, konnte in der Pax5 Mutante mit der deletierten Homeodomäne, weniger Plasmablasten in vitro detektiert werden. Dies konnte auch in vivo in Verbindung mit weniger Keimzentrum B Zellen beobachtet werden. Zusätzlich, wurden zwei weitere Pax5 Mutanten generiert, die Beide ein verkürztes Pax5 Protein exprimieren. Eine Mutante zeigt eine Verkürzung des Pax5 Proteins am Anfang der C-terminalen Transaktivierungsdomäne, die andere Mutante expremiert jedoch noch einen Teil der Transaktivierunsdomäne. Die Deletion der ganzen Transaktivierungsdomäne zeigte einen Arrest in der frühen B Zellentwicklung, welches bereits in Pax5-defizienten B Zellen beobachtet werden konnte. Unerwarteterweise, zeigte die andere Pax5 Mutante CD19 Expression. Jedoch, ist auch in dieser Mutante die B-Zell-Entwicklung in einem frühen Stadium blockiert.

Abstract

(Englisch)

B lymphocytes are part of the hematopoietic system and are crucial for generating high-affinity antibodies, which provide humoral immunity against foreign pathogens. B cell lineage commitment is initiated at the pro-B cell stage and is maintained throughout B lymphopoiesis. B cell development is controlled by a multitude of external signals and transcription factors, including the paired box protein 5 (Pax5). The multifunctional transcription factor Pax5 fulfills a dual role in B cell development: it represses non-B cell lineage genes and simultaneously activates B cell lineage-specific genes. By doing so, Pax5 induces B cell commitment and controls the maintenance of B cell identity throughout B cell development. Importantly, B-lymphopoiesis is arrested at an early uncommitted progenitor stage in the absence of Pax5. The Pax5 protein is composed of several conserved domains, which have so far only been characterized in cell lines in vitro. To investigate the function of these domains by mutagenesis in vivo, we generated four different Pax5 mutant mice lacking individual domains. Two Pax5 mutant mouse lines have been generated in which either the homeodomain was deleted in frame or two mitogen-activated protein kinase (MAPK) phosphorylation sites were mutated. Although B cell development was normal in these mice, in vitro stimulation of mature B cells with lipopolysaccharide or in vivo stimulation with 4-hydroxy-3-nitrophenyl acetyl- keyhole limpet hemocyanin (NP-KLH) revealed impaired B cell activation. The phosphorylation mutant displayed delayed cell proliferation in vitro and decreased levels of the immunoglobulin isotypes IgG3, IgM and IgG2b in vitro and in vivo, respectively. Interestingly, the Pax5 mutant in which the homeodomain was deleted showed a decreased percentage of activated B cells and increased plasmablasts upon LPS stimulation. In line with this, less germinal center (GC) B cells and higher levels of plasmablasts could be detected in the spleen and lymph nodes post NP-KLH immunization. In addition, decreased switching to IgG3, IgM and IgG2b could be observed in vitro and in vivo. In addition, two mutant mouse strains, containing a frameshift mutation leading to a truncated Pax5 protein lacking the C-terminal transactivation domain to different degrees, were generated. Complete deletion of the C-terminal transactivation domain resulted in a developmental arrest at the onset of B-lymphopoiesis, which was similar to that of the Pax5 knockout mice. The presence of the first few amino acids of the transactivation domain in the second mouse mutant facilitated the activation of selected Pax5 target genes such as Cd19, but still showed an arrest in B cell development at a pro-B cell-like stage.

Autor*innen

Sarah Grünbacher

Haupttitel (Englisch)

Characterization of distinct functional domains of Pax5 in vivo

Paralleltitel (Deutsch)

Charakterisierung von funktionalen Domänen von Pax5 in vivo

Publikationsjahr

2017

Umfangsangabe

71 Seiten : Diagramme

Sprache

Englisch

Beurteiler*in

Meinrad Busslinger

Klassifikationen

30 Naturwissenschaften allgemein > 30.00 Naturwissenschaften allgemein: Allgemeines ,

30 Naturwissenschaften allgemein > 30.03 Methoden und Techniken in den Naturwissenschaften

AC Nummer

AC14490921

Utheses ID

42416

Studienkennzahl

UA | 066 | 830 | |

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