Die Entdeckung neuer Protein-Biomarker aus biologischen Proben, die für therapeutische, diagnostische oder prognostische Zwecke eingesetzt werden, ist eine große Herausforderung im wissenschaftlichen Forschungsgebiet der „Proteomik“ und es ist ein langer Prozess bis zur klinischen Anwendung.
Die Massenspektrometrie (MS) ist die Schlüsseltechnologie für die Analyse und Identifikation von Proteinen aus „proteomischen“ Experimenten, da sie die höchste analytische Sensitivität aufweist. Dennoch fallen Proteine mit niedrigen stöchiometrischen Konzentrationen, sowie phosphorylierte Proteine häufig unter die Nachweisgrenze, wodurch potenzielle Protein-Biomarker nicht erkannt werden können. Deshalb ist es dringend erforderlich Prozesse der Probenvorbereitung und Methoden zu verbessern, um vor der massenspektrometrischen Analyse die Probenkomplexität zu vermindern, störende Hintergrundkomponenten zu entfernen und niedrig abundante Komponenten anzureichern. Das Proteome besteht aus Peptiden mit sehr unterschiedlichen chemischen Eigenschaften. Daher gibt es keine einzelne Trennmethode, welche den Anforderungen aller Peptid-Typen entspricht. Eine sensitive Analyse benötigt daher parallele Trennungen mit unterschiedlichen Methoden für die unterschiedlichen Proteine.
In dieser Studie wurden neue chromatographische Methoden entwickelt und validiert, um die Anreicherung und Trennung von Peptiden für proteomische Analysen biologischer Proben zu verbessern. Dafür wurden drei unterschiedliche Strategien angewendet: (i) Hydrophile Interaktions-Chromatographie (HILIC), (ii) elektrostatisch repulsive Interaktions-Chromatographie (ERLIC), und (iii) die Verwendung einer neuen monolithischen Säule mit immobilisierten Rutil nano-TiO2 [TiO tief2 ] Partikel. Schließlich wurde der on-line Transfer der Probe von der ersten Dimension (HILIC, ERLIC) zur RPLC-MS Analyse verbessert.
Im Rahmen der HILIC-Studie wurde eine mit nicht modifiziertem Kieselgel (silica) gepackte Trennsäule eingesetzt und die mobilen Phasen für die Auftrennung von polaren Peptiden optimiert. Das Potenzial der entwickelten chromatographischen Methode wurde anhand der Auftrennung von Peptiden eines tryptischen Verdaus von HeLa Proteinen veranschaulicht. Die Ergebnisse wurden mit einer 1-D Auftrennung der Peptide auf einer C18 RP-Säule verglichen. Es zeigte sich, dass die Anwendung des multidimensionalen Ansatzes deutlich höhere ProteinIdentifikationsraten im Vergleich zur 1-D Trennung. Darüber hinaus zeigte die Analyse der Peptide mit polaren Seitenketten, dass intra- und inter-molekulare Interaktionen auf der Kieselgel-Phase einen essentiellen Einfluss auf den Retentions-Mechanismus der Peptide ausüben.
Im Rahmen der ERLIC Studie wurden zwecks Verbesserung der Auftrennung und Identifikation von Peptiden unterschiedliche Mobile Phase Bedingungen getestet. Das Ergebnis zeigte, dass die höchste Trenn-Leistungsfähigkeit auf einer schwachen Anionen-Austauschsäule (WAX) und unter Einsatz der Mobilen Phase A mit dem niedrigsten Anteil an wässrigem Puffer (90%ACN, 10mM MPh, pH2) erzielt wurde.
In einer weiteren Studie wurde eine neue monolytische Säule, die immobilisierte rutile nano-TiO2 [TiO tief2 ] Partikel beinhaltet, auf ihre Fähigkeit der spezifischen Bindung und Anreicherung von phosphorylierten Peptiden getestet. Die spezifische Bindungsfähigkeit von Phosphopeptiden der Säule wurde anhand des Einsatzes von tryptisch verdauten bovinem α-casein und Proteinen eines HeLa Zell-Lysates bestätigt. Die Verwendung dieser neuen Säule könnte für ein multidimensionales On-line-System (z.B.: ERLIC-TiO2 [TiO tief2 ] -RPLC-MS, SCX-TiO2 [TiO tief2 ] -RPLC-MS) nützlich sein, um Identifikationsraten und die Sequenzabdeckung von phosphorylierten Stellen zu erhöhen.
Im Großen und Ganzen weisen die in dieser Arbeit beschriebenen chromatographischen Methoden ein großes Potenzial für die Verwendung in einem multidimensionalen Trennsystem auf. Daher war es schließlich das Ziel die Herausforderung der Lösungsmittelinkompatibilität, beim On-line Transfer der Probe aus der ersten Trenndimension (HILIC, ERLIC) auf die RPLC-MS Analyse, anzugehen. Das Problem dieser Inkompatibilität wurde erfolgreich gelöst, indem vor dem Beladen von 10μl-20μl Probenfraktionsvolumen auf die C18-Trap-Säule der zweiten Dimension eine 500μl Puffer Kapillare installiert wurde.
Auf Basis dieser finalen Ergebnisse könnte jede der im Rahmen dieser Dissertation optimierten HPLC Trennbedingungen eingesetzt und in einem online multidimensionalen Trennsystem implementiert werden, so wie es im letzten Kapitel dieser Arbeit vorgeschlagen wird. Zukünftige Experimente könnten neue Konzepte für die Anwendung von online multidimensionalen Trennsystemen beinhalten, die zum Beispiel anwendbar sind für: HILIC-RPLC-MS, ERLIC-RPLC-MS oder ERLIC-TiO2 [TiO tief2 ] -RPLC-MS.