Titelaufnahme

Einführung: Das Tamm Horsfall Protein (THP) ist das am häufigsten vorkommende Glykorotein im menschlichen Urin. Ca. 30% seines Molekulargewichts besteht aus Kohlenhydraten. Obwohl es intensiv beforscht wurde ist die Rolle von THP noch immer unklar. Dem Protein wurden zahlreiche Eigenschaften zugeschrieben: Als antiviraler Stoff, als zytoprotektives Reagenz welches interstitielle Zystitis verhindert, als Bindungspartner und Regulator von Zytokinen, als Interaktionspartner des Komplementsystems oder als Modulator des angeborenen Immunsystems. Kürzlich wurde entdeckt, dass THP auch als Interaktionspartner von Scavengerrezeptoren (SR) agieren kann.

Das humane granuläre Zymogenprotein 2 (GP2) ist dem THP sehr ähnlich. Es wurde gezeigt, dass beide wichtige Eigenschaften teilen. Wie THP ist auch GP2 sehr stark glykosyliert. Am wichtigsten ist jedoch, dass beide Moleküle die Fähigkeit haben, pathogene Escherichia coli zu binden.

Ziel der Studie: Aufgrund des hohen Zuckeranteils von THP war es von großem Interesse herauszufinden, ob THP an SR über Kohlenhydrate oder über das Proteingerüst bindet. Ein weiteres Ziel war es zu untersuchen, ob GP2, ähnlich dem THP einBindungspartner von SR ist.

Methoden: THP wurde aus Urin durch Salzpräzipitation gewonnen. Chemische Deglykosylierung wurde mithilfe von Trifluormethansulfonischer Säure (TFMSA) durchgeführt. Um die Bindung von deglykosyliertem THP (degTHP) zu SR zu testen wurde degTHP biotinyliert und mit SR exprimierenden Zelllinien inkubiert. Um zu untersuchen, mit welchem Zucker THP an SR bindet wurden SR exprimierende Zellen mit monomeren Zuckern koinkubiert.Weiters wurde biotinyliertes GP2 (GP2-bio), welches im Baculovirussystem exprimiert wurde, mit SR exprimierenden Zellen inkubiert. Die Affinität von GP2 zum Scavengerrezeptor auf endothelialen Zellen (SREC-I) wurde mithilfe eines Lineweaver-Burk Diagramms bestimmt. Weiters wurde die Bindung und Internalisierung von GP2-bio durch dendritische Zellen (DCs) untersucht. Eine Rezeptor-Liganden Präzipitation wurde verwendet um neue THP/ GP2 bindende Strukturen zu isolieren. Isolierte Proteine wurden mittels Massenspektrometrie bestimmt.

Ergebnisse: THP wurde durch Salzpräzipitation isoliert und mittels TFMSA deglykosyliert. SREC-I und SR-AI waren weiterhin in der Lage, degTHP zu binden, während SR-BI seine Bindungsfähigkeit verlor. THP Bindung an SRBI konnte durch Fukose verhindert werden. Weiters konnte nachgewiesen werden, dass GP2-bio ein Bindungspartner von SREC-I und SR-AI ist. Die Affinität von GP2-bio zu SREC-I betrug 39.55 nM. GP2-bio wurde von DCs gebunden und daraufhin internalisiert. Die Inhibition von DCs mit anti SREC-I Antikörpern war nicht in der Lage, die GP2-bio Bindung zu verhindern. Mittels der Rezeptor-Liganden Präzipitation wurden Proteine isoliert und durch MS identifiziert. Jedoch wurden vorwiegend nur intrazelluläre Proteine isoliert, welche nicht als Kandidaten für THP/GP2 bindende Moleküle angesehen werden können.

Diskussion: Unsere Experimente weisen darauf hin, dass SREC-I und SR-AI THP über ihr Proteingerüst binden, SR-BI jedoch über Zuckeranteile. Endständige Fukosemoleküle könnten die Hauptinteraktionspartner von SR-BI und THP sein. Weiters wurde festgestellt, dass GP2-bio ein Ligand von SREC-I und SR-AI ist, jedoch nicht für SR-BI. Glykosylierungsprozesse innerhalb des Baculovirussystems, welche sich vom humanen Verzuckerungsvorgängen unterscheiden, könnten für die fehlende Bindung von GP2 und SR-BI verantwortlich sein. Weiters konnte gezeigt werden, dass GP2 ein Ligand von DCs ist, welcher nach der Bindung internalisiert wird. Interessanterweise kann die Bindung von GP2 durch Präinkubation mit anti SREC-I Antikörpern nicht verhindert werden. Das weist auf zusätzliche GP2 bindende Strukturen auf DCs hin.

Introduction: The Tamm Horsfall protein (THP) is the most abundant glycoprotein in the human urine. Approximately 30% of the molecular weight is constituted by carbohydrate moieties. Despite intensive research, the role of THP is still not completely understood. The protein has been described to have antiviral properties, to act as a cytoprotective agent that prevents interstitial cystitis, to bind cytokines and thereby regulate the cytokine levels, to influence the complement system, or to modulate the innate immune system. Recently, it was shown that THP is a ligand of different scavenger receptors (SRs). The human zymogen granule protein 2 (GP2), the closest related homologue of THP, has been shown to share important properties with THP. Like THP, GP2 is heavily glycosylated. Most importantly, both molecules have the capability to bind pathogenic Escherichia coli.

Aim of the study: In this study the binding characteristics of THP and GP2 to SRs have been elucidated. Since THP is highly glycosylated, it was of interest, whether binding to SRs occurs via the protein backbone or the sugar moiety. A further goal was to determine, whether GP2 is, like THP, an interaction partner of SRs.

Methods: THP was isolated from urine using salt precipitation. Chemical deglycosylation was performed by Trifluormethanosulfonic acid (TFMSA). Deglycosylated THP (degTHP) was biotinylated and incubated with SR expressing cell lines to test the binding. THP was co-incubated with monomeric sugars to investigate inhibition of THP/SR binding. Furthermore, biotinylated GP2 (GP2-bio), expressed by a baculovirus system, was incubated with different SR expressing cells to evaluate binding. The affinity of scavenger receptor expressed on endothelial cells (SREC-I) to GP2 was determined. Binding to dendritic cells (DCs) and internalization by DCs was investigated. A receptor pull down assay was performed to isolate new THP/GP2 binding structures on DCs. Mass spectrometry (MS) was performed to identify isolated proteins.

Results: THP was isolated by salt precipitation and deglycosylated by TFMSA. SREC-I and SR-AI bound degTHP while SR-BI did not. THP binding to SR-BI could be inhibited by fucose. GP2-bio was shown to be a binding partner of SREC-I and SR-AI. The affinity of SREC-I to GP2-bio is 39.55 nM. GP2 is bound by DCs and internalized. Additionally, GP2 binding to DCs could not be inhibited by anti SREC-I antibodies. By utilizing a receptor pull down assay, proteins of a DC lysate were isolated and identified by MS.

Discussion: Our experiments indicate that SREC-I and SR-AI bind THP via its protein backbone. SR-BI binding is highly dependent on the sugar moiety of THP. In particular, terminal fucose molecules on THP appear to mediate the interaction to SR-BI GP2 is a ligand for SREC-I and SR-AI, but not for SR-BI. Inappropriateglycosylation processes within the baculovirus system might be the reason forthe failure of the binding to SR-BI. Additionally, GP2 seems to have a role ininternalisation in DCs. Further GP2 binding receptors seem to be present onDCs, since binding of GP2 to DCs could not be inhibited by anti SREC antibodies.