Titelaufnahme

Die Aufnahme von Glutamat durch den Glutamat-Transporter spielt eine wichtige Rolle in der Homeostase des Gehirns. Die Anreicherung von Glutamat in dem Synaptischen Spalt kann zu Erregungstoxitizität führen. Funktionell beeinträchtigte Glutamat-Transporter wurden mit verschiedenen zerebralen Krankheiten wie zum Beispiel Schizophrenie oder Amyotrope Laterale Sklerose in Verbindung gebracht. Die Veröffentlichung der Kristallstruktur des Aspartat Transporters (GltPh) im Jahre 2004, isoliert aus Pyrococcus horikoshii, hat unser Wissen über die Struktur-Funktion Beziehung einen großen Schritt weitergebracht. Inzwischen wurden Kristallstrukturen von GltPh in mehreren Konformationen gelöst. Wichtige Erkenntnisse über den Mechanismus des Substrattransportes konnten aus dem Vergleich der verschiedenen Konformationen gewonnen werden. Um die Zusammenhänge von Struktur und Funktion besser zu verstehen, muss der Transportprozess mit atomarer Auflösung untersucht werden. In diese Studien verwendeten wir Moleküldynamik Simulationen, wobei wir sowohl klassische konventionelle Simulationen durchführten, als auch die Methode „Steered Molecular Dynamics“ einsetzten. Ziel der Studie war es, den Transportprozess direkt zu untersuchen. The modellierte Pfad des Substrattransportes zeigte zwei wichtige lokale konformationelle Veränderungen, welche zentrale Schaltelemente im Transportprozess darstellen. Der Erste beinhaltet die Assemblierung der Bindungsstelle für das zweite Natrium, wobei Simulationen zeigten, dass Aminosäure T308 dabei eine wichtige Rolle spielt. Die zweite Veränderung beinhaltet das Aufbrechen ionischer Wechselwirkungen an der zytosolischen Seite des Transporters und betreffen Aminosäuren E192, K290 und Y195. Anschließend überprüften wir experimentell diese Voraussagen über die Rolle von T308 in der Dynamik der zweiten Natrium-Bindungsstelle. Wir mutierten diese Aminosäure, reinigten den Transporter auf und rekonstituierten diesen in Proteoliposomen. Experimente, welche die Aufnahmen des Substrates durch den Transporter in Proteoliposomen quantifizieren, bestätigte die Bedeutung der Hydroxyl-Seitenkette der Aminosäure T308. Der Austausch der positiven Ladungen des Lysins 290 mit einer negativen Ladung durch die Mutation zu Glutamat führt zu einer Reduktion der Substrattransportes im Vergleich zum Wildtype. Zusammen genommen erlauben die Ergebnisse aus dieser Studie jenen Sequenz der Events mit atomarer Auflösung zu definieren, die den Transport von Substrate durch GltPh erlauben.

Uptake of glutamate by the glutamate transporter plays an important role in maintaining the glutamate homeostasis in brain. Accumulation of extracellular glutamate at the neuronal synapse can lead to excitotoxicity. Defective glutamate transporter function has been proposed to be involved in various neurological disorders including amyotropic lateral sclerosis and schizoprenia. Studies on structure function relationship in human glutamate transporters have largely advanced after the publication of the crystal structure of an aspartate transporter (GltPh) from an archaea named Pyrococcus horikoshii in 2004. By now, crystal structures of GltPh are available in several states and they provide important insights into the mechanism of substrate transport across the membrane. In order to understand the structure function relationship better in this class of transporters, it essential to study the transport process at atomic resolution. In this study, an accelerated molecular dynamics approach called as steered molecular dynamics was used in combination with conventional molecular dynamics simulation to model the substrate translocation pathway. The modeled translocation pathway showed two important local conformational changes as key switches in the translocation pathway. The first involved the maturation of the second sodium binding site and simulations showed T308 to play an important role in second sodium binding. The second conformational change involved the disruption of an ionic interaction network involving E192, K290, and Y195 at the cytoplasmic side of the transporter. To probe the role of T308 in second sodium binding, site directed mutagenesis was performed and the purified protein was reconstituted into proteoliposomes. [3H]L-aspartate uptake assays performed with proteoliposomes revealed an important role for the side chain hydroxyl group of T308 in sodium binding. Charge reversal of lysine at position 290 to a glutamate resulted in the reduction of substrate uptake in proteoliposomes, in comparison to wild type GltPh. Taken together, these observation provide information on the sequence of events leading to the internalization of substrate in GltPh, at an atomic resolution.