Titelaufnahme

Hintergrund

Spannungsabhängige Ionenkanäle sind Proteine welche der Regulation der Erregbarkeit von Neuronen und Muskelzellen dienen. Diese Kanäle sind auch für die Generation von Aktionspotentialen verantwortlich, welche die Weiterleitung von Impulsen in Neuronen und die Kontraktion von Muskelzellen kontrollieren. Ionenkanäle gehören zur Familie der „P-loop Kanäle“ und die meisten dieser Kanäle sind wichtige Zielstrukturen für die Entwicklung von Pharmaka. Obwohl 3D Kristallstrukturen für einige Mitglieder dieser Familie verfügbar sind, kann die Struktur der physiologisch und pharmakologisch wichtigen eukaryotischen spannungsabhängigen Natriumkanäle nur durch Homologiemodelle auf der Basis von Kristallstrukturen prokaryotischer Natriumkanäle vorhergesagt werden. Unser Ziel war es festzustellen, ob die seit längerer Zeit verfügbaren Kristallstrukturen bakterieller Kaliumkanäle oder die vor kurzem publizierten Strukturen prokaryotischer Natriumkanäle besser geeignet sind, die Struktur der ionenleitenden Pore des Natriumkanals NaV1.4 vorherzusagen. Um diese Frage zu beantworten wählten wir eine indirekte Vorgangsweise: Das Derivat des Lokalanästhetikum Lidocain, QX222, ist eine permanent geladene und damit membranimpermeable quartäre Ammoniumverbindung. Während Lidocain zur Erreichung seiner Bindungsstelle im inneren Vestibulum des Kanals zunächst durch die Zellmembran diffundieren muss, kann QX222 dieselbe Bindungstelle nur durch Benutzung eines hydrophilen Zugangsweges im Kanal selbst erreichen. Ein solcher Zugangsweg existiert in der im Herzen exprimierten Isoform des Natriumkanals (NaV1.5), aber nicht in anderen Isoformen. Allerdings wurde gezeigt, dass Mutationen der Isoform NaV 1.2 und NaV1.4 (I1575A) einen solchen Zugangsweg zum Extrazellulärraum (EAP) schaffen können (Ragsdale et al., 1994; Sunami et al., 2001). Einige Publikationen haben molekulare Modelle dieses EAP beschrieben (Bruhova et al., 2008). Ergebnisse früherer Studien unserer Gruppe deuteten darauf hin dass der EAP durch den Kontakt zweier Aminosäuren verschlossen wird (Zarrabi et al., 2010). Eine dieser Aminosäuren – I1575 – liegt im extrazellulären Anteil des Transmembran-Segments S6 der Domäne IV während die andere Aminosäure – K1237 – ein Teil des “P-loops” der Domäne III und wichtig für die Ionenselektivität des Kanals ist. Allerdings ist in der ersten publizierten Kristallstruktur eines prokaryotischen Natriumkanals, NaVAb, (Payandeh et al., 2011) ein Tryptophan im “P-loop” der Domäne III – W1531 – zwischen beiden vorher erwähnten Aminosäuren positioniert. Folglich untersuchten wir ob durch Mutationen an der Position 1531 ein EAP geschaffen würde.

Resultate

Elektrophysiologische Messungen wurden unter Anwendung der “Whole-cell patch clamp” Technik an transient transfizierten tsA201 Zellen durchgeführt. Extrazellulär appliziertes QX222 (500 µM) blockierten jeweils 18±3% and 15±2% des Ausgangsstroms in den Mutanten W1531A and W1531G. In diesen beiden Konstrukten war die Dauer der Blockentwicklung extrem schnell (Zeitkonstanten: ~3s und ~2s in jeweils W1531A and W1531G, i.e. ~10-20 fach schneller als in der Mutante I1575A (~40s). Daher wurde durch die Mutationen an der Position 1531 ein EAP für schnellen Zugang von QX222 geschaffen, wie es auf Basis der Kristallstruktur des Kanals NaVAb vorhergesagt worden war.

Dieser neue von uns beschriebene EAP wurde weiters hinsichtlich der Permeabilität für einige Ionenspezies mittels elektrophysiologischer Methoden und „in silico“ untersucht. Die durch die Mutationen geschaffene Pore war in Computersimulationen ausreichend groß für die Permeation von QX222 und experimentell konnte ein Permeation durch das große Tetramethylammonium – Ion nachgewiesen werden. In Zukunft können die einzigartigen Eigenschaften des EAP zur Untersuchung der Bindungseigenschaften von Lokalanästhetika genutzt werden.

Zusammenfassung

Die Kristallstruktur von prokaryotischen Natriumkanälen ist bezüglich der Vorhersage der Struktur der extrazellulären Porenregion eukaryotischer Natriumkanäle präziser als die entsprechenden Strukturen prokaryotischer Kaliumkanäle.

Background

Voltage-gated ion channels are essential proteins for cellular excitability as they are necessary for generation of action potentials in neurons, as well as in cardiac and muscle cells. Action potentials trigger synaptic transmission in neurons, and contraction in muscle cells. These proteins belong to the family of p-loop channels, and most of the family members are important pharmaceutical targets for different classes of drugs. Although 3D crystal structures of some members of this family are available, for the physiologically and pharmaceutically important eukaryotic voltage-gated sodium channels the structure can only be predicted by homology models. Our aim was to test if the traditionally used bacterial potassium channels, or the more recently described prokaryotic sodium channels provide better results in predicting the ion conducting pore structure of the mammalian skeletal muscle type sodium channel NaV1.4. To answer this question, we have used an indirect experimental approach. QX222 is a permanently charged, membrane impermeable quaternary amine analogue of lidocaine. While the frequently used local anaesthetic lidocaine is believed to reach its binding site, which is located in the internal vestibule of the channel, through the cell membrane, QX222 can only access this binding site via a hydrophilic route across the channel protein. This pathway exists in the cardiac isoform (NaV1.5), but not in other isoforms. In addition, mutations have been shown to open such an external access pathway (EAP) in NaV1.2 and NaV1.4 e.g. (I1575A) (Ragsdale, McPhee, Scheuer, & Catterall, 1994; Sunami, Glaaser, & Fozzard, 2001), which is insensitive to extracellular QX222 application. Amino acids surrounding this pathway were mapped and modelled in several publications e.g. (Bruhova, Tikhonov, & Zhorov, 2008). Previous data from our lab suggested that two residues along this EAP directly contact each other (Zarrabi et al., 2010). One of them - I1575 – is located on the upper S6 transmembrane segment of domain IV, while the other – K1237 - is in on the p-loop of domain III and is important for the ion selectivity of the channel. In the first crystal structure of a prokaryotic sodium channel, NaVAb(Payandeh, Scheuer, Zheng, & Catterall, 2011), a tryptophan residue - W1531 - of the DIII p-loop is located between these two EAP lining residues. Therefore, we tested the hypothesis that mutations at site W1531 create an EAP.

Results

Whole-cell patch clamp measurements were performed on transiently transfected tsA201 cells. Extracellular QX222 (500 µM) blocked currents through W1531A and W1531G by 18±3% and 15±2%, respectively. In both constructs block development was extremely fast (time constants: ~3s and ~2s for W1531A and W1531G), i.e. ~10-20 fold more rapid than I1575A (~40s). Thus, mutations at site 1531 open an access pathway allowing for rapid block by QX222, as predicted from the crystal structure of NaVAb.

This new EAP was tested for its size and permeability for different ion species with electrophysiological and computational methods. The cavity created by the mutations was large enough to accommodate QX222 in the simulations, and experimentally the large tetra-methyl-ammonium ion was conducted by the EAP. The unique features of the novel mutations opening this EAP may be useful in the future for better understanding of binding of local anaesthetic drugs to the sodium channels.

Summary

We conclude that the use of crystal structures of prokaryotic sodium channels allows for better predictions of the pore structure of eukaryotic sodium channels than homology models based on crystallized potassium channels.