Titelaufnahme

Auf der Oberfläche von aktivierten Blutplättchen löst P-Selektin die Plättchen-Leukozyten Interaktion aus und fördert so die Thrombogenese. Das P-Selektin Gen (SELP) ist polymorph und es konnten 17 nicht-synonyme Polymorphismen identifiziert werden. Der Thr715Pro Polymorphismus steht im Verdacht, die P-Selektin Funktion signifikant zu beeinflussen. Wie sich jedoch der Polymorphismus auf die P-Selektion Funktion auswirkt, war bisher nicht bekannt. Das Ziel dieser Arbeit war es, den Einfluss des 715Pro Polymorphismus auf die Synthese, posttranslationale Prozessierung, Oberflächenexpression, Sekretion und Funktion von P-Selektin aufzuklären. Dazu wurden HEK293 Zellen, die kein P-Selektin endogen exprimieren, mit dem P-Selektin Wildtyp (715Thr) und der Variante (715Pro) transfiziert, um den Effekt des Polymorphismus zu untersuchen. Es konnte bestätigt werden, dass das rekombinante P-Selektin ein identisches Glykosylierungsmuster wie das endogene P-Selektion in humanen Plättchen aufweist. Beim Vergleich der mit 715Pro P-Selektin und Wildtyp Selektin transfizierten Zellen konnten folgende Unterschiede festgestellt werden: (1) mit 715Pro transfizierte Zellen weisen etwa 50% weniger terminal glykolisiertes P-Selektin auf und zeigen eine höhere Akkumulation von unreifem P-Selektin im Golgi Apparat; (2) das meiste 715Pro Selektin wird nicht durch die Enzyme des Golgi Apperates modifiziert; (3) mit 715Pro transfizierte Zellen exprimieren ca. 20% weniger P-Selektin auf der Zelloberfläche und sezernieren 38% weniger P-Selektin ins Zellkulturmedium; (4) mit 715Pro transfizierte Zellen binden rund 29% weniger Neutrophilen-ähnliche HL-60 Zellen. Diese in-vitro Ergebnisse wurden von uns in Studien zur Plättchen-Monozyten Aggegationsbildung mit Blut von gesunden Probanden und Artheroslerose Patienten bestätigt. Wir fanden, dass es im Blut von Probanden mit der 715Pro P-selektin Mutante zu weniger Plättchen-Monocyten Aggregaten kommt als im Blut von Patienten mit der 715Thr P-Selektin Mutation. Wir vermuten daher, dass die 715Pro Variante die terminale Glykosilierung im Golgi Apparat vermindert und es dadurch zu einer reduzierten Anzahl an reifem P-selektin und folglich auch zu weniger oberflächlichem und sekretiertem P-Selektin kommt. Diese reduzierte Oberflächenexpression von 715Pro P-Selektin führt in der Folge zu einer ineffizienten Adhesion der 715Pro Mutante tragenden Zellen mit HL-60 Zellen oder Monozyten.

P-selectin on the surface of activated platelets triggers platelet-leukocyte interaction and promotes thrombogenesis. The P-selectin gene (SELP) is polymorphic and 17 non-synonymous polymorphisms were identified. The Thr715Pro polymorphism was proposed to significantly impact on P-selectin function. The aim of the project was to investigate the influence of the 715Pro polymorphism on P-selectin synthesis, post-translational processing, surface expression, secretion and function. P-selectin wild-type (715Thr) and variant (715Pro) were transfected into HEK293 cells, which do not express endogenous P-selectin, and the effects of the polymorphism on P-selectin were evaluated. We could confirm that the recombinant P-selectin has an identical glycosylation pattern as endogenous P-selectin in human platelets. By comparing 715Pro P-selectin transfected cells with wild-type P-selectin transfectants, we found (1) 715Pro transfectants have ~50% less terminally glycosylated P-selectin and accumulate more immature P-selectin in Golgi; (2) the majority of 715Pro P-selectin is not modified by Golgi enzymes; (3) 715Pro transfectants have ~20% less P-selectin on the cell surface and secrete about 38% less P-selectin during culture; (4) 715Pro transfectants bound ~29% less neutrophil-like HL-60 cells. Finally, we confirmed our in vitro findings by analysis of platelet-monocyte aggregate formation in human blood from healthy individuals and atherosclerosis patients. We found that the individuals with platelets containing 715Pro P-selectin had lower number of platelet-monocyte aggregates in circulation than people with platelets having 715Thr P-selectin. We conclude that the 715Pro variant impairs terminal glycosylation of P-selectin in Golgi, leading to reduced amounts of mature P-selectin and subsequently less surface expression and secretion of P-selectin. The reduced surface expression of 715Pro P-selectin contributes to inefficient adhesion of 715Pro carrying cells to HL-60 cells or monocytes.