Titelaufnahme

Die Leader Protease (Lpro) des Maul- und Klauenseuche Virus ist ein vielversprechendes Zielobjekt zur Entwicklung von antiviralen Medikamenten. Lpro ist das erste Protein, welches im viralen RNA Genom kodiert ist. Die Translation kann an zwei alternativen Startkodons initiiert werden, die zur Bildung von Labpro und Lbpro führen, welche sich durch 28 Aminosäuren am N-Terminus unterscheiden. Während einer viralen Infektion entsteht durch die Entfernung von sechs bis sieben Aminosäuren vom C-Terminus eine dritte Form, die sLbpro genannt wird. Lpro schneidet sich selbst durch einen intra- (cis) oder intermolekularen (trans) Prozess vom viralen Polyprotein, wobei gezeigt wurde, dass die cis Reaktion bevorzugt wird.

Die Hemmung von Lpro verhindert seine Abtrennung vom Kapsidprotein VP4, welches dadurch nicht länger in der Lage ist sich korrekt in das virale Kapsid einzugliedern. Um potente und spezifische Wirkstoffe gegen Lpro entwickeln zu können, ist es entscheidend die Substratspezifität und den Mechanismus der Selbstprozessierung der Protease genau zu verstehen. Diese Arbeit beschreibt daher eine Vielzahl an Experimenten zu diesem Zweck.

Über die Struktur der "Prime"-Seite der Substratbindungsregion von Lpro gibt es nur spärliche Informationen. Aus diesem Grund haben wir die Kristallstruktur von sLbpro im Komplex mit dem Epoxid-basierten Inhibitor E64-R-P-NH2 bestimmt. Die Struktur zeigt die Interaktion von Arg und Pro des Inhibitors mit den S1' und S2' Bindungsstellen von sLbpro. Des Weiteren gibt die Struktur eine Erklärung wie Lbpro durch die einzigartige Anordnung von den drei sauren Aminosäuren Asp 49, Glu 96 und Glu 147 in der Substratbindungsstelle basische Aminosäuren an der P1 und der P1' Position akzeptieren kann.

Des Weiteren wurde die unterschiedliche Enzymaktivität von Lbpro und sLbpro gegenüber Polyprotein-Substraten untersucht. Die Spalteffizienz von Lbpro wurde weder durch Mutationen an der P1 und P1' Stelle noch durch die Substitution mit der eIF4GI-Spaltstelle beeinflusst. Im Gegensatz dazu sank die Effizienz von sLbpro mutierte Polyprotein-Spaltstellen zu schneiden deutlich und das Substrat mit der eIF4GI-Spaltstelle konnte überhaupt nicht geschnitten werden. Durch die Einfügung von weiteren 70 Aminosäuren von eIF4GI, die die zuvor charakterisierte Bindungsstelle für Lbpro enthielt, konnte die Effizienz von sLbpro die eIF4GI-Spaltstelle zu schneiden allerdings wieder hergestellt werden. Demnach wird für die effiziente Spaltung von eIF4GI und dem Polyprotein-Substrat die stabilisierende Interaktion von der eIF4GI-Bindungsstelle oder der letzten sechs Cterminalen Aminosäuren benötigt. Die Tatsache, dass Lbpro und sLbpro gleichzeitig in der infizierten Zelle vorkommen könnte auf einen Mechanismus hindeuten um die Enzymeigenschaften während der viralen Infektion zu modifizieren.

Darüber hinaus nahmen wir uns vor die Struktur und Dynamik der intramolekularen Selbstprozessierung von Lbpro mittels NMR zu untersuchen. Zu diesem Zweck wurden Lbpro-Varianten untersucht, deren C-Terminus um fünf Aminosäuren verlängert war. Es konnten Änderungen an der chemischen Verschiebung von bestimmten Aminosäuren der Substratbindungskluft festgestellt werden, die auf eine intramolekulare Interaktion zwischen dem C-Terminus und der Substratbindungsstelle hindeuten. Allerdings, konnten keine Signale für C-terminale Aminosäuren detektiert werden, die mit der Substratbindungskluft interagierten. Im Gegensatz dazu, konnten für C-terminale Aminosäuren, die ungebunden waren und nicht interagierten, in der Tat Signale beobachtet werden.

Zusammenfassend kann gesagt werden, dass durch die innewohnende Eigenschaft des C-Terminus nur flüchtig zu interagieren die direkte Untersuchung des C-Terminus während der intramolekuaren Prozessierung schwierig ist.

The leader protease (Lpro) of the foot-and-mouth disease virus represents a promising target for the development of antiviral drugs.

Lpro is the first protein encoded on the viral RNA genome and its translation can be initiated at two alternative start codons giving rise to Labpro and Lbpro which differ by 28 residues at their N-terminus. A third form arises during infection when Lbpro removes six to seven residues from its C-terminus to create sLbpro. Lpro cleaves itself off the viral polyprotein either inter- (trans) or intramolecularly (cis); however, the cis reaction was shown to be preferred. The inhibition of Lpro prevents its cleavage from the capsid protein VP4 which is no longer able to integrate into the viral capsid correctly. In order to design potent and specific inhibitors, thorough understanding of the substrate specificity and the self-processing mechanism of Lpro is crucial. Thus, this thesis covers a number of experiments to provide this knowledge.

Structural information on the prime side of the substrate binding region of Lpro is sparse. To this end, we solved the crystal structure of sLbpro in complex with the epoxide-based inhibitor E64-R-P-NH2 which shows the interaction of Arg and Pro of the inhibitor with the S1' and S2' subsite of sLbpro.

Furthermore, the structure explains how Lbpro can accept a basic residue at the P1 and P1' position using a unique alignment of the three acidic residues Asp 49, Glu 96 and Glu 147 in the active site. Furthermore, the differences in the cleavage activities of Lbpro and sLbpro were observed. The cleavage efficiency of Lbpro on a polyprotein substrate was neither affected by mutations at the P1 and P1' position nor by the substitution with the eIF4GI cleavage site. In contrast, sLbpro cleavage of mutated polyprotein cleavage sites was significantly delayed and cleavage of the eIF4GI cleavage site completely failed. However, the introduction of further 70 residues of eIF4GI containing the previously characterized binding site for Lbpro restored the cleavage efficiency of sLbpro on the eIF4GI cleavage site. Thus, for efficient cleavage of eIF4GI and the polyprotein substrate stabilizing interactions either via the eIF4GI binding site or via the final six C-terminal residues are required. The fact that both Lbpro and sLbpro are present in the infected cell might suggest a mechanism to modify the properties of the enzyme during viral infection.

Moreover, we attempted to investigate the structure and dynamics of intramolecular selfprocessing of Lbpro by NMR. To this end, Lbpro variants were investigated that were extended at the C-terminus by five amino acids. Amide shift changes for residues of the substrate binding cleft were observed indicating intramolecular interactions between the C-terminus and the substrate binding cleft. However, no signals could be detected for interacting Cterminal residues. In contrast, for C-terminal residues that were unbound and not interacting intramolecularly signals could indeed be observed. Concluding, due to the intrinsic nature of the C-terminus to interact transiently, the direct investigation of the C-terminus during intramolecular processing remains elusive.