Titelaufnahme

Die Frage wie gut Brustkrebspatienten auf ihre Therapie ansprechen ist sehr schwierig vorherzusagen und daher von enormer Bedeutung. Diese Vorhersage ist jedoch ein Hauptanliegen in der Anwendung neuer Therapeutika. Diese Studie hatte das Ziel, die individuelle Behandlung im Kampf gegen den Krebs besser zu definieren und neue Therapieansätze zu generieren. In dieser Arbeit werden zwei unabhängige Vorgehensweisen erläutert. Im ersten Teil bedienten wir uns dem heterogenetischen Erscheinungsbild von Brustkrebspatienten. Wir analysierten systematisch den potentiellen Einfluss von diversen Krebs-Genen auf die zelluläre Fitness (z.B. Zellviabilität oder Teilungsrate) als Reaktion auf die Behandlung mit einer Reihe von genetischen oder chemischen Perturbationen. Daraus resultierte Sensitivität oder Resistenz der Zellen. Hierfür entwickelten wir ein multiplexes Screening-Verfahren. Mit Hilfe isogener Tumorzellen konnten wir so tausende potentielle Gen-Gen oder Gen-Pharmaka Interaktionen untersuchen. In einem einzigen Ansatz konnten bis zu 100 verschiedene genetische Varianten gleichzeitig getestet werden. Das erhöhte die Zahl der getesteten Interaktionen in einem Reaktionsansatz auf das Hundertfache. Unter Berücksichtigung der klinischen Relevanz und dem direkten therapeutischen Zusammenhang mit Brustkrebs war die Entdeckung einer resistenten Interaktion zwischen einem Phosphoinositid-3-Kinase (PI3K) Inhibitor und der Aktivierung von NOTCH und c-MYC am interessantesten. Zusammenfassend kann man sagen, dass dieses vorgestellte Screening-Verfahren ein leistungsfähiges Instrument darstellt, um besseren Einblick in Genfunktionen und Wirkung von Pharmaka zu erlangen. Das erleichtert Entscheidungen in der klinischen Anwendung. Die Signatur von onkogenen Signalwegen spiegelt die Biologie und das klinische Erscheinungsbild von Krebs wieder und ist somit Angriffspunkt spezifisch gerichteter Therapien. Im Moment werden mehr und mehr ganze Signalwege als therapeutischer Angriffspunkt bevorzugt als individuelle Gene dieses Signalweges. Aus diesem Grund suchten wir nach einem möglichen therapeutischen Fenster in der PI3K-PDK1-AKT Signalkaskade. Dieser Signalweg ist bei vielen Brustkrebspatienten aberrant reguliert und führt meist zu einer schlechten Prognose der Patienten. Wir konzentrierten uns auf die PI3K Signalkaskade und erlangten dadurch vielversprechende Einsichten in der Regulation von PDK1. Bis heute existieren nur wenige Berichte über mono-ubiquitinierte humane Proteine. Aber bei allen Berichten stand diese post-translationale Modifikation in Zusammenhang mit regulatorischen Funktionen. Von uns unerwartet lag das PDK1 Protein mono-ubiquitiniert in verschiedenen humanen Zelllinien vor. Das deutet darauf hin, dass diese Modifikation ein üblicher und regulierter Prozess ist. Die Ubiquitinierung erfolgt in der Kinase-Domäne des PDK1 und ist von der Aktivität der Kinase aber unabhängig. Im Zuge eines Ubiquitin Protease Bibliothek-Screens identifizierten wir die ubiquitin-spezifische Protease 4 (USP4) als wichtigstes und einziges Enzym, welches die Ubiquitinierung von PDK1 in vivo und in vitro inhibiert und mit PDK1 an der Plasmamembran kolokalisiert. Diese Tatsache deutet auf eine direkte Deubiquitinierung hin. Zusammenfassend fanden wir, dass die regulierte Modifikation des PDK1 durch ein einzelnes Ubiquitin eine zusätzliche und unerwartete Komponente in der Komplexität des zentralen Signalnetzwerkes darstellt. Berücksichtigt man die Attraktivität der Ubiquitin-Maschinerie als neuen therapeutischen Angriffspunkt, so liefern diese neuen Erkenntnisse Potential für die Entwicklung neuer Pharmaka.

How breast cancer patients respond to treatment outcome is not easy to predict and represents a major concern in the application of therapeutics. This study aims to better define personalized treatment options and yield new applications to fighting cancer by two independent approaches. We first modelled the heterogenous genetic make-up of breast cancer patients and systematically analysed the potential impact of cancer genes on cellular fitness ( i.e. cell viability or doubling time) as response to a collection of genetic and chemical perturbations - that is sensitivity or resistance of the cells. We developed a multiplexed screening platform and investigated thousands of potential gene-gene and gene-drug interactions in an isogenic cell line model. Up to 100 genetic alterations could have been interrogated in a single well assay, increasing the number of interactions screened per well so far by up to two orders of magnitude. Considering the clinical relevance and direct implication in breast cancer treatment, we assigned the resistant interaction between PI3K inhibitors and activation of NOTCH and c-MYC as the most interesting. Thus the presented screening strategy can be considered as a powerful tool to gain deeper insight into gene function and drug action, hence to precisely guide clinical treatment decisions.

Oncogenic pathway signatures mirror the biology of cancer and clinical outcome and therefore hold the promise to guide targeted therapy. Given that much attention is being paid on how to specifically and directly attack pathways rather than individual genes, prompted us to search for a therapeutic window targeting the PI3K-PDK1-AKT signalling as this pathway is aberrantly regulated in a large proportion of breast cancer patients and associated with poor prognosis. We zoomed into the PI3K signalling cascade and obtained highly promising insight into the PDK1 regulation.To date, only few mono-ubiquitin conjugated human proteins have been reported yet in all examples this post-translational modification displays a critical regulatory function. Unexpectedly, a diverse panel of human cell lines expressed mono-ubiquitinated PDK1 at varying levels, indicating that this modification is a common and regulated process. The small molecule ubiquitin conjugates to the kinase domain of PDK1 but this attachment does not require PDK1 kinase activity. By applying a library of ubiquitin proteases, we further document the ubiquitin-specific protease 4 (USP4) as a prime enzyme that inhibits PDK1 ubiquitination in vivo and in vitro and co-localizes with PDK1 at the plasma membrane, suggesting direct deubiquitination.

Together, the regulated modification of PDK1 by a single ubiquitin moiety generates an additional, unpredictable layer of complexity in this critical signalling network. Considering the clinical attractiveness of targeting the ubiquitination machinery, our data provides potential novel therapeutic angles for drug development.