Titelaufnahme

GABA (g-Aminobuttersäure) ist der häufigste Neurotransmitter im Zentralnervensystem erwachsener Säugetiere (Macdonald and Olsen 1994).

GABAA Rezeptoren vermitteln schnelle Inhibition durch GABA, während langsame Inhibition über GABAB Rezeptoren ausgelöst wird. GABAA Rezeptoren sind GABA aktivierte Chloridkanäle, und Angriffspunkte vieler klinisch bedeutsamer Wirkstoffe. (Sieghart et al., 2012). Barbiturate, neuroaktive Steroide, Anaesthetika und Benzodiazepine sind einige der Modulatoren die an GABAA Rezeptoren wirken (D'Hulst et al., 2009). Viele Wirkstoffe sind nicht selektiv für spezifische Rezeptor Subtypen, was zu Nebenwirkungen führt. Daher ist ein Hauptziel der Substanzentwicklung, selektive Wirkstoffe zu finden. Der häufigste GABAA Rezeptor besteht aus 2a, 2b, und einer g Untereinheit. Die GABA Bindestellen befinden sich an den extrazellulären Kontaktstellen zwischen einer a und einer b Untereinheit (a-b+ Interface) (Smith and Olsen, 1995). Die Benzodiazepin Bindestelle befindet sich am extrazellulären a+g- Interface (Sigel and Buhr, 1997). Es wurde kürzlich gezeigt, dass das Pyrazoloquinolinon CGS 9895 über eine neu beschriebene Bindestelle am extrazellulären a+b- Interface (Ramerstorferet et al. 2011) moduliert.

In dieser Dissertation habe ich die Wirkungen von Pyrazoloquinolinonen an der extrazellulären a+b- Bindestelle von GABAA Rezeptoren charakterisiert. In der ersten von zwei Publikationen wurden die Effekte von 32 Strukturanalogen zu CGS 9895 in a1b3 GABAA Rezeptoren untersucht, mit dem Ziel die Ähnlichkeit der Wirkung zu CGS 9895 zu beschreiben und potentere Substanzen zu identifizieren (Varagic et al., 2013a). Die Ergebnisse von elektrophysiologischen Messungen von 20 der 32 Substanzen wurden für quantitative Struktur-Wirkungs-Beziehungs (QSAR) Analysen verwendet um den Einfluss von Variationen der chemischen Struktur auf die über die a1+b3- Bindestelle vermittelte Potenz der Substanzen zu verstehen. Dabei gelang es, ein Modell für den Einfluss von zwei Schlüsselpositionen in der Pyrazoloquinolinon Struktur auf die Potenz zu erstellen. Ein weiteres Ergebnis dieser Arbeit war die Entdeckung von kompetitiven Null Modulatoren der a1+b3- Bindestelle. Diese haben keine eigene Wirkung auf die Rezeptoren, aber verdrängen die Positivmodulatoren von der a1+b3- Bindestelle. Diese Substanzen wurden dann in der zweiten Publikation verwendet. In der zweiten Arbeit habe ich die Effekte von LAU 177 an GABAA Rezeptoren untersucht. LAU 177 hat von allen untersuchten Substanzen die höchste Efficacy in den a1b3 und a1b3g2 Rezeptoren und wurde daher für weitere Untersuchungen gewählt. Ich konnte zeigen dass diese Substanz an allen untersuchten GABAA Rezeptoren die GABA induzierten Ströme stark erhöht. Die Modulation war in ab und abg2 Rezeptoren vergleichbar, aber abhängig vom Typ der a und b Untereinheit die im Rezeptor ist. Ich habe auch erstmals die Wirkung dieser und einigen weiteren Substanzen an d-hältigen Rezeptoren (a1,4,6b3d) untersucht. LAU 177 hat, im Gegensatz zu einem zweiten untersuchten Pyrazoloquinolinon, unerwartet starke Wirkung auf a1b3d Rezeptoren, aber nicht auf a4,a6b3d Rezeptoren ausgeübt. Die Wirkung von LAU 177 auf a1b3d Rezeptoren war dreifach höher als in den korrespondierenden a1b3 und a1b3g2 Rezeptor Subtypen.

Weitere Untersuchungen an a1b3d Rezeptoren haben gezeigt dass auch diese Wirkung nicht nur in a1b3g2, sondern auch an a1b3d Rezeptoren großteils über das a+b- Interface entsteht.

Zusammenfassend wurde ein Super-Modulator für a1b3d GABAA Rezeptoren beschrieben und es wurde gezeigt, dass die die Wirkstärke von Substanzen nicht nur von deren Struktur, sondern auch von jeder im Rezeptor vorhandenen Untereinheit- unabhängig von ihrer Beteiligung an der Bindestelle-abhängt.

GABA (g-aminobutyric acid) is the most abundant neurotransmitter in the mammalian nervous system (Macdonald and Olsen, 1994). In the adult nervous system, GABAA receptors mediate the fast inhibitory effects of GABA, while slow inhibition is mediated by GABAB receptors.

GABAA receptors are GABA-gated chloride channels and they are the site of action of many clinically important drugs (Sieghart et al., 2012).

Barbiturates, neuroactive steroids, general anesthetics, and benzodiazepines, are some of the modulators that act via GABAA receptors (D'Hulst et al., 2009). Many of them modulate all GABAA receptors with similar potency and efficacy and this lack of selectivity for certain receptor subtypes leads to unwanted side effects. Thus searching for subtype selective ligands is a major goal in drug development. The majority of GABAA receptors consists of two a, two b, and one g subunits. The GABA binding sites are located at the extracellular a-b+ interface (Smith and Olsen, 1995), and the benzodiazepine binding site is located at the a+g- interface (Sigel and Buhr, 1997). It was found recently that the modulation of the pyrazoloquinolinone CGS 9895 is mediated via a novel binding site located at the extracellular a+b- interface (Ramerstorfer et al. 2011).

In this thesis I investigated the effects of pyrazoloquinolinones mediated via the a+b- binding site of GABAA receptors. The results of this thesis have been published in two papers. The first of the two papers deals with the effects of 32 structural analogues of CGS 9895 at a1b3 and a1b3g2 GABAA receptors to understand whether they mediate their effects in a way similar to CGS 9895 and to identify compounds with higher potency (Varagic et al., 2013a). A quantitative structure activity relationship (QSAR) analysis for 20 of the 32 pyrazoloquinolinones and pyrazolopyridinones was then applied to the results of the electrophysiological experiments in order to understand the effects of variations in their chemical structure on the potency at the a1+b3- binding site. This resulted in a model that predicts the effects of substituents at two pyrazoloquinolinone key positions on potency.

Another outcome of this paper was the identification of competitive null modulators for the a1+b3- binding site. These compounds inhibit the effects of positive allosteric modulators acting via the a1+b3- interface, and were used in the second paper.

In the second paper I investigated the effects of LAU 177 at GABAA receptors. LAU 177, among all compounds we had characterized at that time, showed the highest efficacy of modulation at a1b3 and a1b3g2 receptors and therefore this compound was chosen for further investigations. I demonstrated that this compound strongly enhanced GABA-induced currents at all GABAA receptors investigated. The extent of modulation was comparable in ab and abg2 receptors but depended on the type of a and b subunits present within the receptors. I also for the first time investigated the effects of this and some other compounds on d-containing receptors (a1,4,6b3d). LAU 177, in contrast to the other pyrazoloquinolinones investigated, showed an unexpectedly high efficacy at a1b3d but not at a4,a6b3d receptors. The efficacy of LAU 177 at a1b3d receptors was threefold higher than at the corresponding a1b3 and a1b3g2 receptor subtypes. Further investigations at a1b3d receptors indicated that this compound not only at a1b3g2, but also at a1b3d receptors elicited most of its effects via the a+b- interface.

In summary we identified a super-modulator for a1b3d GABAA receptors and demonstrated that the efficacy of a compound not only depends on the compound structure but is also influenced by each subunit present in the receptor irrespective of its contribution to the drug binding site.