Picornaviren sind kleine huellenlose RNA Viren, die mehrere wichtige menschliche und tierische Pathogene beinhalten, wie den Poliovirus, den humanen Rhinovirus, den Hepatitis A Virus und den Maul- und Klauensaeuchevirus. Ein erfolgreicher Kampf gegen diese Viren setzt ein effektives antivirales Medikament voraus, um die haeufig aeusserst spezifischen Impfungen zu komplementieren. Konservierte Regionen des viralen Genoms beinhalten potentielle Zielgene fuer entsprechende antivirale Medikamente. Dabei handelt es sich oft um hochspezifische virale Enzyme. Das picornavirale 2C Protein und seine Vorstufe 2BC sind bisweilen die einzigen unstrukturierten Protein unbekannter Struktur.
Aufklaerung der Struktur des 2C wuerde dessen Funktion und die dahinterstehenden Mechanismen erhellen und notwendige Informationen fuer das Design potentieller antiviraler Medikamente liefern. Kuerzlich wurde gezeigt, dass 2C, eine putative ATP hydrolysierende Helikase, an Membranen und virale RNA bindet. 2C ist Teil des viralen Replikationskomplexes, der in Clustern von Wirtszellmembranvesikeln gefunden werden kann. Die Sequenz des 2C ist eine der am staerksten konservierten Regionen aller Picornaviren und seine Deletion ist fatal fuer den Virus.
Aufgrund der Art seiner physiologischen Umgebung ist das Protein weitestgehend hydrophob und traditionelle rekombinante Technologien scheiterten bisher bei der Produktion ausreichender Mengen des 2C fuer strukturelle Studien. Hier wird eine extensive bioinformatische Analyse praesentiert, um die problematischsten Regionen des Proteins und potentielle strukturelle Domaenen zur Produktionen abgeschnittener Proteinkonstrukte zu identifizieren. Strukturmodelle der zentralen ATPase Domaene, basierend auf dem naechsten Homolog und dem C-terminalen, putativen Zinkfinger werden gezeigt. Eine Reihe von Konstrukten des HRV14 2C wurden hergestellt, um unterschiedliche abgeschnittene und chimaerische Varianten des Proteins zu expremieren.
Extensive Optimierung von Puffern und Aufreinigungsprozaeduren fuehrten zu drei potentiellen Proteinvarianten, die sich fuer strukturelle Studien anbieten. The entfernen von 38 Aminosaeuren am N-Terminus, zusammen mit der Verwendung von Detergentien und imidazolfreien Umgebungen machten das 2C loeslich und stabil fuer einige Zeit. Fusion der abgeschnittenen Version des 2C mit dem C-Terminus des Maltose bindenden Proteins fuehrten zu einem gut loeslichen und stabilen Proteins. Allerdings lies es sich nicht kristallisieren. Die Expression der zentralen ATPase Domaene resultierte in der Expression einen gaenzlich unloeslichen Proteins, welches unter denaturierenden Bedingungen aufgereinigt und in den nativen Zustand zurueckgefalten werden konnte. Ein kurzes Peptid, das eine putatives Zinkfingermotiv beinhaltet wurde aufgereinigt. Allerdigns scheiterte die Strukturanalyse mittels NMR Spektroskopie. Die Analyse des Zinkgehaltes wies nicht auf spezifische Chelatisierung hin. Obwohl letztenendes keine strukturelle Information ueber das 2C erarbeitet werden konnte, zeigen die erhaltenen Proteinvarianten ausreichend hohe Qualitaet fuer strukturelle Studien.