Titelaufnahme

Die Peritonealdialyse (PD) ist eine kostengünstige Nierenersatztherapie bei Patienten mit terminaler Niereninsuffizienz. Bei der PD wird das Peritoneum als semipermeable Membran verwendet, um mittels PD-Lösungen Abfallprodukte aus dem Blut in die Peritonealhöhle zu entfernen. Trotz der Effektivität dieser Lösungen bei der Entfernung von Toxinen und Wasser bewirkt deren unphysiologische Zusammensetzung, mit hohen Konzentration von Glukose und deren Abbauprodukte (GDPs), eine schwere Schädigung der Peritonealmembran mit progressiven morphologischen und funktionalen Veränderungen im Laufe der PD, die häufig im Therapieversagen endet. Hyperglykämische Milieus, wie PD oder Diabetes, aktivieren stressassoziierte Signalwege und Effektorproteine, deren Interaktion über zelluläre Umprogrammierung mit Zellüberleben (oder Tod) entscheidet. Die bioinformatische Auswertung des Proteoms von Peritonealzellpopulationen kann entscheidende molekulare Mechanismen als Reaktion auf PD-Stress untersuchen. Vorzeitige Seneszenz als Reaktion auf Glukosestress kann zu PD induzierten Pathomechanismen beitragen. Seneszente Zellen unterscheiden sich nicht nur durch ein verändertes Protein-Expressionsprofil, sondern auch durch posttranslationale Modifikationen, wie zB O-GlcNAcylierung von Mesothelzellenproteinen als Reaktion auf glucosebasierte PD-Lösungen. Diese posttranslationale Veränderung, abhängig von Glukose- und Glutaminangebot, moduliert das Überleben der Zellen und die Toleranz gegenüber Stress. Der erste Teil dieser Dissertation analysiert proteomische Veränderungen, die während der zellulären Seneszenz von menschlichen peritonealen Mesothelzellen auf der Ebene der Proteinexpressionsprofile und der Modifikation mit O-GlcNAc auftreten. Es wird beschrieben, dass seneszente Zellen ihren O-GlcNAcylierungsgrad im Vergleich zu jungen Zellen nur reduziert zu modulieren vermag. PD-Stress führt zu oxidativen Protein-, Lipid- und DNA-Schäden, mit beeinträchtigter Zelllebensfähigkeit. Der zweite Teil dieser Dissertation untersucht ein neuartiges Proteomverfahren zur Identifizierung spezifischer Ziele oxidativer Schäden, basierend auf Thiolmodifikationen redoxempfindlicher Proteine. Die Weiterentwicklung derartiger redox-proteomischer Analysen der Peritonealzellpopulationen könnte oxidative Modifikationen als neue Biomarker in der PD identifizieren. Peritoneale vaskuläre Veränderungen, die sich als PD-assoziierte Vaskulopathie und Neoangiogenese manifestieren, sind ein entscheidender limitierender Faktor in der PD, der eng mit dem Verlust der Ultrafiltration im PD-Patienten einhergeht. Die Modulation der peritonealen Glutaminspiegel durch Supplementierung von PD-Lösungen mit Alanyl-Glutamin (AlaGln) –Dipeptid reduzierte in Vorstudien in in vitro- und in vivo-PD-Modellen Zytotoxizität und Entzündungen, verbesserte die Immunkompetenz und reduzierte die PD-assoziierte Neoangiogenese. Der dritte und letzte Teil dieser Dissertation konzentriert sich auf den Effekt von AlaGln auf die Stress-Reaktion von Endothelzellen bei Exposition gegenüber PD-Lösungen. Zugabe von AlaGln reduzierte Endothelzellenschäden und proteomische Veränderungen, die durch eine PD-Flüssigkeitsbelastung verursacht wurden. Ein Cross-omics Vergleich mit transkriptomischen Daten aus klinischen Biopsien von Kindern an der PD unterstreicht das klinische Potential der Ergebnisse im Endothelzell-Modell. Zusammengefasst zeigt diese Dissertation bisher unbeschriebene Veränderungen der Proteinabundanz und der posttranslationalen Modifikationen von Mesothelzellen während der zellulären Seneszenz auf, beschreibt einen neuen proteomischen Workflow, um redoxempfindliche Proteine als Reaktion auf PD-Stress zu untersuchen, und definiert molekulare Mechanismen in Endothelzellen, die den zytoprotektiven Effekten der AlaGln-Supplementierung von PD-Lösungen zugrunde liegen können

Peritoneal dialysis (PD) is a cost effective renal replacement therapy for patients with end-stage renal failure. In PD, the peritoneum is used as semi-permeable membrane to exchange waste products from blood into the peritoneal cavity by means of PD fluid. Although effective in removing toxins and water from uremic patients, the unphysiological composition of PD fluids, characterized by high glucose concentration and glucose degradation products has been shown to cause severe damage to the peritoneal membrane over time on PD with a progressive series of morphological and functional transformations that ultimately lead to PD therapy failure. Hyperglycaemic milieus, as the one observed in PD or diabetes, are known to cause severe cellular damage and subsequent stress-activated signaling pathways determining cellular reprogramming and eventually cell survival or death. Proteomic evaluation of peritoneal cell populations can reveal crucial molecular mechanisms adopted by the different cytotypes in response to PD stress. Premature senescence is described to occur in response to glucose stress, and it might contribute to PD induced patho-mechanisms. Senescent cells might respond and survive stressful conditions differently reflected not only by an altered protein expression profile but also by different post-translational modifications levels. Recently our group showed the ability of protein O-GlcNAcylation undertaken by mesothelial cell proteins in response to glucose-based PDF exposure. This posttranslational modification, regulated by glucose and glutamine availability and modulated upon cellular needs, enhances cell survival and tolerance to stress. In the first part of this thesis we analyzed proteomic abundance changes and levels of O-GlcNAcylation in senescent human peritoneal mesothelial cells. We describe how senescent cells show an impaired ability to fully modulate their level of O-GlcNAcylation per se together with a distinct protein expression profile when compared to young cells. PD stress is strongly characterized by oxidative cellular insults which results in proteins, lipids and DNA damage and eventually in impaired cell viability. With the growing interest for identification of specific targets of oxidative damage, in the second part of this thesis we present a novel proteomic method for exploring thiol modifications of redox-sensitive proteins. This pilot experiment, bearing although few limitations, might in the future allow redox proteomic analysis of peritoneal cell populations. This novel approach could explore oxidative modifications in PD with the aim of identifying new biomarkers for improving PD but also to evaluate antioxidant therapeutic effects on a molecular level. In attempt to improve biocompatibility, modulation of glutamine levels in PD fluids in the form of Alanyl-Glutamine (AlaGln) supplementation, has shown to have multi-beneficial effects in in vitro and and in in vivo PD models. The third and last part of this thesis focuses on the characterization of endothelial cells injury and stress response upon exposure to conventional PD fluid with/without intervention with AlaGln dipeptide. Peritoneal vascular changes manifested as diabetes like damage of vessels, vasculopathy and neoangiogenesis are crucial limiting factor in PD therapy as closely associated with loss of ultrafiltration in PD patient. Endothelial cell damage and proteomic changes caused by PD fluid exposure were effectively counteracted by the AlaGln supplementation resulting in the dissolution of the majority of PD fluid perturbed biological processes and in the enrichment of cellular protective ones. Cross-comparison with transcriptomics data from clinical biopsies of children on PD support to the findings in our proteomic endothelial model with common perturbed players and remarks potential therapeutic effects for AlaGln supplementation in PD fluid.