Zusammenfassung
Der Transkriptionsfaktor Achaete-Scute (Ascl2) aus der Familie der basic Helix-loop- Helix Proteine (bHLH) spielt eine essentielle Rolle für Stammzellen im Dünndarm des Menschen wie auch der Maus. Das Gen Ascl2 kodiert für das Protein Ascl2. Ascl2 hat Einfluss auf die eigene Aktivität durch eine Rückkopplungsschleife, die durch eine basale Aktivierung von Wnt reguliert wird und ermöglicht dadurch ein abgegrenztes Kompartiment für Stammzellen im Darmepithelium. Aus diesem Grund wird Ascl2 als Schlüsselregulator der Determinierung zwischen Proliferation und Differenzierung im Darm angesehen. Die Expression von Ascl2 ist auch in die Tumorbildung von kolorektalen Karzinomen involviert, da Ascl2 die Proliferation von malignen Zellen antreibt. Das bringt die Frage auf, welche Eigenschaften von Ascl2 zur Tumorentwicklung im Darm führen? Verwandte Proteine von Ascl2 zeigen, dass deren biologische Wirkung von deren Phosphorylierungsstatus abhängt. Deswegen wurde in dieser Arbeit folgende zentrale Frage adressiert: Welchen Einfluss hat die Regulation von Ascl2 durch Phosphorylierung auf die homöostatische Aufrechterhaltung von Stammzellen und Zelldifferenzierung im Darm?
Um den Phosphorylierungsstatus von Ascl2 in vitro zu bestimmen, sowie herauszufinden welche Cyclin-abhängigen Kinasen daran beteiligt sind und wie sich dies auf die Proteinstabilität von Ascl2 auswirkt, wurden biochemische Experimente durchgeführt. Um die Effekte von Ascl2 Phosphorylierung zu bestimmen, wurden Darmorganoide der Maus mit einem Doxycyclin-induzierbaren Vektorsystem transferiert, welches die Expression von Wildtyp-Ascl2 beziehungsweise eine nicht- phosphorylierbare Mutante erlaubt.
Die Resultate zeigen, dass Ascl2 hauptsächlich von der Kinase Cdk1/CyclinB phosphoryliert wird und die Inhibierung Cyclin-abhängiger Ascl2 Phosphorylierung sich positive auf Stabilität und Abundanz des Proteins auswirkt. Es konnte gezeigt werden, dass inhibierte Phosphorylierung von Ascl2 zu verschlechtertem Wachstum von Darmorganoiden führt und sogar Abwehrmechanismen auslöst, um die Expression von dephosphoryliertem Ascl2 zu supprimieren. Diese Untersuchungen liefern erste Einblicke in die Rolle von phosphoryliertem Ascl2 bei der Aufrechterhaltung eines Stammzellekompartiments im Dünndarm.