Titelaufnahme

Die Cyanobakterien der Gattung Planktothrix sorgen häufig für toxische Algenblüten in Binnengewässern. Im Zuge dieser Algenblütenbildung wird zum einen das Ökosystem beeinträchtigt, z.B. durch Verschlechterung von Lichteinfall oder Sauerstoffzehrung, und zum anderen kann die Nutzung dieser Gewässer für die Gewinnung von Trinkwasser oder zur Erholungssuche für Mensch und Tier schädlich sein wenn bioaktive Peptide oder Toxine produziert werden. Für das Cyanobakterium der Gatt. Planktothrix sind insgesamt sieben Familien von bioaktiven/toxischen Peptiden bekannt, die jeweils zahlreiche Strukturvarianten ausbilden. Dies sind die Aeruginosine, die Anabaenopeptine, die Canopeptoline, die Microcystine, die Microginine, die Microviridine und die Planktocycline. Diese Peptide werden entweder von nichtribosomalen Peptidsynthetasen (NRPS), Polyketidsynthasen (PKS) oder einer Kombination aus NRPS/PKS produziert. Zusätzlich werden auch noch Peptide ribosomal synthetisiert und anschließend modifiziert. Die jeweiligen NRPS/PKS sind durch große Gene kodiert, welche wiederum in Genclustern organisiert sind. Die genetische Basis zur Synthese der bioaktiven Peptide (oder SekundärMetaboliten, SM) kann von Genotyp zu Genotyp sehr unterschiedlich sein, z.B. können die Gene vorhanden sein oder fehlen, oder die Zusammensetzung bzw. die Anordnung der Gene innerhalb der Gencluster variieren. Innerhalb einzelner Regionen kann die Variabilität in der Nukleotidsequenz besonders groß sein. Durch den Erwerb zusätzlicher akzessorischer Enzyme oder einer herabgesetzten Substratspezifität wird eine simultane Produktion verschiedener Peptidstrukturvarianten erreicht. Dadurch wird im Zuge der Ausbildung von Algenblüten typischerweise eine hohe Peptidstrukturvielfalt beobachtet, welche auch von einer breiten Bioaktivität begleitet ist. Wahrscheinlich dienen diese vielfältigen Peptide den Cyanobakterien zur chemischen Abwehr von Fraßfeinden oder Konkurrenten.

Das Ziel vorliegender Doktorarbeit war es, genetische Faktoren zu identifizieren, die die hohe Strukturvariabilität innerhalb der Peptidfamilien, speziell in der Gatt. Planktothrix, begründen. Dazu wurden sowohl auf genetischer als auch auf phänotypischer Ebene Untersuchungen, inkl. chemischanalytischer Methoden zur Identifizierung von Peptiden, durchgeführt. Die Verteilung der Gencluster zur Peptidbiosynthese und verschiedene Rekombinationsereignisse, sowie die resultierenden Peptidstrukturen, wurden bei mehr als 120 Planktothrix Stämmen untersucht. Die Stämme stammen alle aus der Kultursammlung des Forschungsinstituts für Limnologie in Mondsee und wurden ursprünglich aus 40 Gewässern in 17 Ländern von drei Kontinenten (Europa, Nordamerika und Afrika) isoliert. Diese Stämme wurden bereits zuvor mittels MultiLocusSequenzanalyse phylogenetisch und ökologisch eingeordnet. Im Zuge meiner Doktorarbeit habe ich drei OpenAccessPublikationen als Hauptautorin verfasst, welche durch das StandardPeerReviewVerfahren der Naturwissenschaften evaluiert wurden.

Kapitel I (veröffentlicht in Harmful Algae) stellt ein gemeinsam verfasstes Manuskript dar, das den Kenntnisstand zur Phylogenie, Morphologie, der ökophysiologischen Anpassung und der Ökologie der Gatt. Planktothrix zusammenfasst. Weiters wurden die Verteilung der Biosynthesegene sowie die genetische Grundlage und Regulierung der Peptidsynthese innerhalb der Gatt. Planktothrix beschrieben. Die bekannten Arten P. agardhii und P. rubescens bilden die phylogenetischen Linien 1 und 2, die typischerweise in der gemäßigten Klimazone vorkommen und Algenblüten bilden. Diese Genotypen enthielten fünf bis sechs von insgesamt sieben charakterisierten BiosyntheseGenclustern. Im Gegensatz dazu enthielten die Arten P. pseudagardhii, P. mougeotii und P. tepida, welche der basalen Linie 3 zugeordnet wurden, diese Biosynthesegene nicht.

In Kapitel II (veröffentlicht in Frontiers in Microbiology, Section Aquatic Microbiology) wird die Evolution des AnabaenopeptinSyntheseweges bei der Gatt. Planktothrix erläutert. Es wurde beobachtet, dass die apn Gene, die für die AnabaenopeptinSynthese kodieren, teilweise verloren gingen und anschließend durch horizontalen Gentransfer (HGT) wieder erworben wurden. Dies war das erste Beispiel zum Transfer der Synthesegene für eine bestimmte NRPS zwischen zwei verschiedenen blütenbildenden Gattungen von Cyanobakterien. Weiters wurde festgestellt, dass Punktmutationen in der Nukleotidsequenz der ersten Adenylierungsdomäne des NRPS Genclusters mit einer reduzierten Substratspezifität einhergehen und dadurch die Aktivierung verschiedener Substrate (Aminosäuren) ermöglichen. Innerhalb der 124 untersuchten Stämme konnte gezeigt werden, dass diese Strukturvariabilität, z.B. in der exozyklischen Position des Anabaenopeptinmoleküls, mit einzelnen Genotypen korreliert.

Kapitel III (veröffentlicht in Frontiers in Microbiology, Section Evolutionary and Genomic Microbiology) beschreibt die Untersuchungen an den vollständigen Genomen von 13 Planktothrix spp. Stämmen, welche die phylogenetische Vielfalt innerhalb der Gatt. Planktothrix repräsentieren. Es wurde eine ausgeprägte Variation der Chromosomengröße beobachtet, d.h. Stämme der Linie 1 hatten ein kleineres Chromosom als Stämme der Linie 2, während das Chromosom der Stämme der Linie 3 sogar noch wesentlich größer war. Insertionsequenzen (ISElemente) oder Genduplikation hatten nur einen kleinen Anteil an der Variation der Chromosomengröße, wohingegen der Erwerb oder Verlust von Genen einen wesentlich größeren Einfluss auf die Chromosomengröße hatte. Tatsächlich wurden einige Regionen entdeckt die “Genomic Islands” darstellen könnten, welche möglicherweise funktionelle Gencluster kodieren und via HGT ins Chromosom integriert wurden. Insgesamt wurden sechs zuvor beschriebene Gencluster identifiziert und auf dem Chromosom lokalisiert, während lediglich der Gencluster für die Microginin Synthese auf Plasmiden gefunden wurde. Interessanterweise zeigten die SMSyntheseGencluster eine Tendenz zur CoLokalisierung, die mit der Phylogenie übereinstimmte. Im Gegensatz dazu, waren die ISElemente eher zufällig im Chromosom verteilt und nicht vermehrt in der Nachbarschaft von SMGenclustern zu finden. Jedoch konnten vermehrt ISElemente in der Nähe von Bruchstellen für ChromosomRestrukturierungen beobachtet werden, was auf eine mögliche Relevanz für die chromosomale Strukturierung hinweist, die beispielsweise das Zusammenrücken von Genclustern der SMSynthese ermöglichte.

Kapitel IV (publiziert in Marine Drugs) fokusiert sich auf die genetischen Grundlagen, die die außerordentlich hohe Diversität der Aeruginosin Peptidproduktion in Planktothrix begründet. Wiederum wurden die oben genannten 124 Stämme verglichen, die aus unterschiedlichen Klimazonen stammen. Sowohl die Gene zur Biosynthese von Aeruginosin als auch die resultierenden Aeruginosin Peptidstrukturen wurden verglichen und Zusammenhänge zwischen genetischer Basis und struktureller Modifikation untersucht. Zahlreiche unbekannte strukturelle AeruginosinVarianten wurden identifiziert. Dieser Ansatz zeigte, dass die hohe Aeruginosin Strukturvariabilität zu einem großen Teil durch zusätzliche Enzyme wie Sulfotransferasen, Halogenasen oder Methyltransferasen begünstigt wurde, welche durch HGT transferiert wurden. Ähnlich wie der AnabaenopeptinBiosyntheseGencluster wurde auch der AeruginosinSyntheseGencluster in erheblichem Maße von HGT beeinflusst, was die strukturelle Vielfalt erheblich erhöhte. Bemerkenswerterweise zeigte die Evolution der AeruginosinSynthesegene einen Zusammenhang mit der Phylogenie und spielte vermutlich eine Rolle bei der Artbildung oder ökologischen Diversifizierung.

Die Ergebnisse dieser Doktorarbeit veranschaulichen, wie enorm umfangreich das Spektrum an Strukturvarianten im Sekundärmetabolismus innerhalb der Gatt. Planktothrix ist. Einzelne Stämme produzieren zahlreiche Vertreter von mehreren verschiedenen Peptidfamilien simultan und das mittels unterschiedlich genetischer und chemischer Prinzipien. Wenngleich der tatsächliche Grund für die Peptidproduktion noch nicht mit Gewissheit fixiert werden kann, ist doch offensichtlich, dass es für den Organismus evolutionäre Vorteile mit sich bringt, und deshalb der hohe Resourcen und Endergieaufwand, den die Peptidproduktion mit sich bringt, in Kauf genommen wird.

The cyanobacterial genus Planktothrix is regularly forming harmful algal blooms, devastating the aquatic environment. The water of affected drinking reservoirs can be toxic for human and livestock due to bioactive peptides produced via their secondary metabolism. Seven common peptide families are described for Planktothrix: the aeruginosins, the anabaenopep-tins, the cyanopeptolins, the microcystins, the microginins, the microviridins and the planktocyclins. The peptides are either produced by non-ribosomal peptide synthetases (NRPS), polyketide synthases (PKS) or a combination of both NRPS/PKS. In addition, the peptides can be ribosomally synthesized and post-translationally modified. The genes encod-ing the synthesis are organized in operons constituting large gene clusters. The genetic basis of peptide synthesis varies between individual genotypes (i.e. clonal isolates or strains) re-garding either the presence/absence of the total gene cluster, the organisation or composition of individual genes or the variability of the nucleotide sequence at certain regions. Through the acquisition of additional accessory enzymes or relaxed substrate specificity, the simultaneous production of various peptide structural variants has been achieved. Thus, high peptide struc-tural diversity, accompanied by a broad bioactivity, is typically observed during bloom for-mation. It is speculated that the cyanobacteria use the diverse peptides for chemical defense against predators or competitors.

Within this PhD thesis, I aimed to identify the genetic factors causing the high structure variability within individual peptide families among the abundant cyanobacteria of the genus Planktothrix. Investigations at genotypic and phenotypic level were performed in combination with chemical analytical techniques. The biosynthesis gene distribution and various recombi-nation events, as well as the resulting peptide structures, were determined among more than 120 Planktothrix strains. The strains were obtained from the culture collection of the Research Department for Limnology in Mondsee and originated from 40 waterbodies located in 17 countries on three different continents (Europe, North America and Africa). Those strains were phylogenetically and ecologically assigned via multi locus sequence analysis previously. Within this thesis, I authored four open access publications, which have been evaluated through the standard peer-review process.

Chapter I (published in Harmful Algae) constitutes a co-authored manuscript reviewing the phylogeny, the morphology, ecophysiological adaptations and the ecology of the genus Planktothrix. Furthermore, the distribution of biosynthesis genes among the genus Planktothrix, and the genetic basis and regulation of bioactive peptide synthesis were de-scribed. The well known species P. agardhii and P. rubescens form the phylogenetic Line-ages 1 and 2, typically occurring in temperate climatic zones and forming algal blooms. Those strains carried five to six out of seven characterized biosynthethic gene clusters. In contrast, the species P. pseudagardhii, P. mougeotii and P. tepida form Lineage 3 and did not contain these specific biosynthesis genes.

In Chapter II (published in Frontiers in Microbiology, Sect Aquatic Microbiology) the evolution of the anabaenopeptin synthesis pathway among the genus Planktothrix was eluci-dated. It was observed that apn genes encoding anabaenopeptin synthesis were partly lost, followed by reacquisition through horizontal gene transfer (HGT), which constituted the first example for transmission of secondary metabolite (SM) synthesis genes between two bloom-forming cyanobacteria. Furthermore, point mutations in the nucleotide sequence encoding the first adenylation domain of the NRPS were found to correlate with relaxed substrate specifici-ty and thereby increased structural peptide diversity (i.e. in the exocyclic position of the ana-baenopeptin molecule).

Chapter III (published in Frontiers in Microbiology, Sect Evolutionary and Genomic Mi-crobiology) describes the complete genomes for thirteen strains, representing the phylogenet-ic diversity within the genus Planktothrix. A pronounced variation in chromosome size was observed, i.e. strains of Lineage 1 had a smaller chromosome than strains of Lineage 2, while the chromosome of strains of Lineage 3 was even larger. A minor contribution in total chro-mosome size variation was attributed to insertion sequence (IS) elements or gene duplication, while gene acquisition or gene loss were found of major influence for chromosome size varia-tion. Indeed, some regions were observed that encode putative functional gene clusters, probably inherited by HGT. Six previously described SM synthesis gene clusters were identi-fied and localized on the chromosome, while only one SM gene cluster was found on plas-mids. Overall, SM synthesis gene clusters showed a tendency of co-localization, which was found congruent with phylogeny. Surprisingly, the IS elements were found rather randomly distributed across the entire chromosome and did not cluster near SM synthesis gene clus-ters. However, a higher frequency of IS element copies within breaking regions of chromo-somal rearrangements indicates a potential relevance in chromosomal structuring, e.g. influ-encing the observed co-localization of SM synthesis gene clusters.

Chapter IV (published in Marine Drugs) focuses on the genetic basis shaping the diver-sity in peptide production of the aeruginosins among Planktothrix by comparing 124 strains from different climatic regions as described above. Both, results from genetic analysis of the biosynthesis gene clusters and peptide structure analysis were compared, and relationships between genetic basis and structural modificication were explored. Many unknown structural aeruginosin variants were identified. This approach showed that the high structural variability was caused to a large extent by additional enzymes (e.g. sulfotransferases, halogenases and methyltransferases) which were acquired through HGT. Similar to the anabaenopeptin bio-synthesis gene cluster, also the aeruginosin synthesis gene cluster was influenced by HGT to a major extend substantially increasing the structural diversity. Notably, Aeruginosin synthesis gene evolution showed a correlation with phylogeny and has had a putative role in speciation or ecological diversification.

The results of this doctoral thesis illustrate the enormous extensive spectrum of struc-tural variation in toxic/bioactivde peptide synthesis within the genus Planktothrix. Individual strains produce numerous strucural variants of several different peptide families simultane-ously using different genetically acquired strategies. Although the actual reason for peptide production cannot yet be determined with certainty, it is obvious that producing diverse pep-tide structures is of evolutionary and ecological advantage justifying the high expenses of re-sources and energy to maintain this remarkable secondary metabolism.